海豚鏈球菌LAMP方法的建立及初步應(yīng)用

張永德　馮世文　李軍

摘要：為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)魚類海豚鏈球菌（Streptococcus iniae），減少由其造成的經(jīng)濟(jì)損失，建立了一種基于Sim基因高效、敏感的海豚鏈球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)739個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法可以特異性地檢測(cè)海豚鏈球菌，而不能檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、副乳房鏈球菌（Streptococcus parauberis）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）等8種參考菌株。對(duì)海豚鏈球菌DNA最低檢測(cè)限為5.32拷貝/μL；對(duì)739個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，8種魚類海豚鏈球菌的平均檢出率為17.67%，池塘水和海水的檢出率分別為13.33%、16.67%；該菌主要發(fā)現(xiàn)于羅非魚腦組織中，其平均檢出率為27.04%（43/159），而其他魚類則主要發(fā)現(xiàn)于皮膚，平均檢出率為24.14%（42/174）；陽(yáng)性樣品主要來(lái)自于2014年6月至9月期間，占總檢出率的65.00%。

關(guān)鍵詞：海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）；鏈球菌??；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；羅非魚

中圖分類號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）15-0099-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.15.025 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Development and Preliminary Application of Loop-mediated Isothermal Amplification （LAMP） Method for Rapid Detection of Streptococcus iniae

ZHANG Yong-de1，F(xiàn)ENG Shi-wen2，LI Jun2，PENG Hao2，LIANG Wan-wen1，YU Yan-ling1，LI Ming1，

YANG Xue-ming1，ZHU Jia-jie1，LUO Hong-lin1，CHEN Fu-yan1，LEI Ai-ying1

（1. Guangxi Key Laboratory for Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture/Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning 530021， China； 2. Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Nanning 530001， China）

Abstract： To develop a rapid and accurate method for detecting Streptococcus iniae and limit the losses because of this disease， a loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay was established with four specific primers designed according to the Sim gene of Streptococcus iniae in GenBank， and totally 739 samples were collected and detected by LAMP. The results showed that the LAMP had a high sensitivity for S. iniae with detection limits of 5.32 copies/μL S. iniae DNA. The LAMP method had a strong specificity， which can be specifically amplified S. iniae， and no amplifications were observed in the 8 reference strains. The detection results of 739 samples showed that the average detection rate of S. iniae in the samples from 8 species of cultured fish was 17.67%， while 13.33% and 16.67% were from pond water and seawater， respectively. The bacteria were found mainly in tilapia brain tissues， and the average positive detection rate was 27.04%， while in other fishes， the average positive detection rate was 24.14%. Higher S. iniae positive carrying rate during Jun to Sep， 2014 was found comparing to Jan to May and Oct to Dec， 2014， with the detection rate reached to 65.00%.

Key words： Streptococcus iniae；streptococcosis；loop-mediated isothermal amplification （LAMP）；tilapia

鏈球菌病是一種細(xì)菌性疾病，對(duì)多種魚類如亞洲石斑魚、鱸魚、銀鯧、日本比目魚、紅鼓魚和羅非魚等造成嚴(yán)重的影響[1-3]。據(jù)估計(jì)，全球魚類每年由鏈球菌造成的經(jīng)濟(jì)損失約2.5億美元。目前，發(fā)現(xiàn)可引起魚類鏈球菌病的鏈球菌亞種主要有無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、副乳房鏈球菌（Streptococcus parauberis）和停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae），其中，海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌已成為魚類，特別是羅非魚鏈球菌病的主要病原[4-6]。在中國(guó)，2001—2006年羅非魚鏈球菌病只是個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)偶發(fā)，累計(jì)死亡率只有5%～15%。然而從2009年開始，羅非魚鏈球菌病大規(guī)模爆發(fā)，并伴隨30%～80%的高死亡率，僅2011年造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)約4億美元。盡管海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌都可引起羅非魚鏈球菌病，但其優(yōu)勢(shì)菌群可能在不同的時(shí)期會(huì)改變。Chen等[7]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)2006和2007年流行的主要菌群為海豚鏈球菌，占總檢出率的94.7%，2009和2011年則變?yōu)闊o(wú)乳鏈球菌，占總檢出率的97.7%。盡管目前無(wú)乳鏈球菌是羅非魚鏈球菌病的主要病原，但自2009年鏈球菌優(yōu)勢(shì)菌群改變以來(lái)，海豚鏈球菌是否仍是中國(guó)魚類的潛在養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)仍未知。

海豚鏈球菌可以感染至少27種重要的海洋和淡水魚類。感染魚類經(jīng)常發(fā)生腦膜腦炎和敗血癥，死亡率高達(dá)30%～50%[8]，海豚鏈球菌已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖最嚴(yán)重的病菌之一。此外，海豚鏈球菌還是機(jī)會(huì)性人畜共患病原，可通過(guò)帶菌魚感染人類[9]，魚類或水環(huán)境中海豚鏈球菌的傳播會(huì)增加人類公共衛(wèi)生的風(fēng)險(xiǎn)。由于海豚鏈球菌與無(wú)乳鏈球菌、副乳房鏈球菌、停乳鏈球菌等鏈球菌在細(xì)菌形態(tài)和染色上極其相似，通常，生化試驗(yàn)是檢測(cè)海豚鏈球菌的主要手段，但其過(guò)程大約需要1～2 d[10]。PCR、核型分型、RAPD和PFGE[11-13]等也可用于海豚鏈球菌檢測(cè)，然而這些方法也比較耗時(shí)，并且可能由于檢測(cè)過(guò)程中多次添加試劑而導(dǎo)致污染。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種敏感、快捷、低成本的檢測(cè)方法，其擴(kuò)增可在1 h內(nèi)完成，通過(guò)熒光染料的濁度或顏色變化即可檢測(cè)產(chǎn)物[14]，檢測(cè)時(shí)間大幅縮短。因此，本研究建立了1種基于海豚鏈球菌Sim基因檢測(cè)的高效、敏感的LAMP檢測(cè)方法，并對(duì)部分魚類海豚鏈球菌的感染狀況進(jìn)行了檢測(cè)，以期為這方面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株及待檢樣品

以臨床分離和鑒定的9株海豚鏈球菌進(jìn)行LAMP方法的構(gòu)建，以廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存的無(wú)乳鏈球菌、副乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、氣單胞菌（Aeromonas veronii）、愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）、哈氏弧菌（Briohatveyi）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）作為參考細(xì)菌。細(xì)菌于28 ℃下在胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）或血瓊脂中培養(yǎng)。從廣西、廣東和云南收集了739個(gè)淡水魚、海水魚樣品以及海水、池塘水樣品用于海豚鏈球菌的檢測(cè)（表1）。

1.2 主要試劑

細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自榮研生物科技公司；SYBR Green I購(gòu)自Invitrogen公司；Bst DNA聚合酶、2×Taq Plus PCR MasterMix、DNA Marker等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)海豚鏈球菌Sim基因序列（EU287919.1-EU287923.1），采用Primer Explorer 4.0軟件（http： /primerexplorer.jp/lamp）設(shè)計(jì)海豚鏈球菌的LAMP引物。其中，F(xiàn)3（5′AAGCAGATTTGGAACAAGC3′）和B3（5′TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCT3′）分別為外側(cè)上、下游引物，F(xiàn)IP（5′TCTGCCAATTGTTTTTGAAG TTCAGTGCACGAGAATTAGATACGC3′）和BIP（5′AACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCT TAGCCGCT3′）分別為內(nèi)側(cè)上、下游引物。然后采用F3和B3進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，以對(duì)比LAMP技術(shù)的靈敏度和特異性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的提取

將海豚鏈球菌和參考細(xì)菌接種到TSB中過(guò)夜培養(yǎng)；腦組織取10 mg于0.9 mL PBS中清洗，在無(wú)菌研缽中研磨；皮膚和腮組織首先接種到血瓊脂平板上培養(yǎng)，然后取其菌落在TSB中培養(yǎng)。將上述樣品各取10 mL，采用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，將DNA濃縮至1.7×102 ng/μL（約5.32×1010 拷貝/μL）。將池塘水與海水離心，進(jìn)行細(xì)菌沉淀，提取DNA后用于LAMP和PCR檢測(cè)。

1.5 LAMP反應(yīng)檢測(cè)

采用Loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)，LAMP反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Reaction Mix 12.5 μL、FIP和BIP各1 μL（40 pmol/μL）、F3和B3各1 μL（50 pmol/μL）、鈣黃綠素25 μmol/L、Bst DNA聚合酶1 μL、1.7×102 ng/μL基因組DNA 2 μL。LAMP反應(yīng)在Eiken LA-320C實(shí)時(shí)濁度計(jì)中進(jìn)行，每6 s讀取OD400 nm值，在63 ℃測(cè)定60 min，然后在80 ℃滅活5 min。以去離子水替代DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.6 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

使用引物F3和B3對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，25 μL PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL PCR master Mix，F(xiàn)3和B3引物各1 μmol/L，1.7×102 ng/μL基因組DNA 2 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 LAMP檢測(cè)的特異性

以攜帶Sim基因的海豚鏈球菌菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水作為陰性對(duì)照，以副乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌、無(wú)乳鏈球菌、氣單胞菌、愛(ài)德華氏菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌共8株魚類常見(jiàn)感染細(xì)菌作為參考菌株，在63 ℃下擴(kuò)增40 min，觀察LAMP對(duì)海豚鏈球菌檢測(cè)的特異性，所用的DNA為從海豚鏈球菌和參考細(xì)菌提取的1.7×102 ng/μL的DNA。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，采用DNAStar 7.10中的ClustalW軟件將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的海豚鏈球菌Sim基因序列比對(duì)分析。

1.8 LAMP檢測(cè)的靈敏性

將海豚鏈球菌DNA進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，稀釋后的濃度范圍為5.32×1010～5.32×100拷貝/μL。然后采用優(yōu)化的LAMP和PCR方法分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并比較其檢測(cè)靈敏度。

1.9 LAMP擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將海豚鏈球菌DNA連續(xù)10倍稀釋為5.32×1010～5.32×100拷貝/μL共11個(gè)濃度梯度，用作LAMP測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)模板，采用F3和B3引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。當(dāng)濁度為0.1時(shí)，由于DNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)與濁度之間存在線性關(guān)系，可以通過(guò)記錄濁度和時(shí)間點(diǎn)來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)LAMP擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線確定細(xì)菌拷貝數(shù)。

1.10 海豚鏈球菌LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)從廣西、廣東和云南省收集的739個(gè)樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，提取DNA，利用LAMP技術(shù)進(jìn)行海豚鏈球菌檢測(cè)，并分析不同魚類、池塘水及海水中海豚鏈球菌的攜帶情況，不同時(shí)間段魚類海豚鏈球菌的感染率，以及海豚鏈球菌在魚體內(nèi)不同組織的分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)的特異性

LAMP檢測(cè)的特異性結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，僅以攜帶Sim基因的海豚鏈球菌作為模板出現(xiàn)濁度曲線，而陰性對(duì)照和參考菌株則均無(wú)濁度曲線。結(jié)果表明，采用引物對(duì)FIP和BIP檢測(cè)海豚鏈球菌具有高度的特異性。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，序列比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，該序列與海豚鏈球菌Sim基因序列相似度達(dá)100%。

2.2 海豚鏈球菌LAMP檢測(cè)的靈敏性

LAMP檢測(cè)靈敏度研究結(jié)果顯示，LAMP對(duì)海豚鏈球菌DNA檢測(cè)的最低濃度為5.32拷貝/μL（圖2）。11個(gè)DNA濃度梯度，LAMP檢測(cè)反應(yīng)所需的孵育期分別為16、18、20、22、23、26、30、35、40、41、45 min，最早檢測(cè)到海豚鏈球菌存在的時(shí)間小于30 min。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，其檢測(cè)的最低濃度為5.32×102拷貝/μL（圖3）。

2.3 LAMP擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用11個(gè)濃度梯度的海豚鏈球菌基因組DNA作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并構(gòu)建LAMP擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.483 4X-10.416，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 8。其中，X表示LAMP反應(yīng)所用的時(shí)間段，Y表示海豚鏈球菌DNA濃度的負(fù)反對(duì)數(shù)（圖4）。

2.4 海豚鏈球菌LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)收集到的739個(gè)樣品進(jìn)行海豚鏈球菌檢測(cè)，其中羅非魚樣品299份，占總樣品量的40.5%，其他魚類樣品380份，占總樣品量的51.42%。LAMP檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示，8種魚類海豚鏈球菌平均檢出率為17.67%，其中羅非魚樣品平均檢出率為20.40%，高于其他7種魚類的15.53%。而在健康羅非魚、池塘水和海水樣品中也檢測(cè)到海豚鏈球菌，其檢出率分別為10%、13.33%和16.67%。

2.4.1 海豚鏈球菌感染階段分析 采用LAMP法對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)并分析樣品所處的階段，結(jié)果見(jiàn)表2。從結(jié)果可以看出，海豚鏈球菌陽(yáng)性樣品主要來(lái)自2014年6月至9月期間。在健康羅非魚中，3個(gè)陽(yáng)性樣品均處于此期間，而來(lái)自廣西、云南和廣東省的患病羅非魚樣品中，海豚鏈球菌在此期間的陽(yáng)性檢出率分別占其總陽(yáng)性率的90.00%（9/10）、65.38%（17/26）和53.33%（8/15），平均為50.98%，在無(wú)癥狀的羅非魚中，57.14%（4/7）的陽(yáng)性樣品來(lái)自該時(shí)期。其他7種魚類，與2014年1—5月和10—12月兩個(gè)階段相比，均發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌陽(yáng)性攜帶率在6—9月最高。

2.4.2 海豚鏈球菌在魚體內(nèi)的組織分布 海豚鏈球菌在魚體內(nèi)的組織分布檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，在所檢測(cè)的羅非魚中，該菌主要發(fā)現(xiàn)于腦組織中，其陽(yáng)性檢出率為27.04%（43/159），然后依次為腮和皮膚，其陽(yáng)性率分別為15.09%（8/53）和11.49%（10/87）；而其他7種魚類則主要發(fā)現(xiàn)于皮膚，其平均陽(yáng)性率為24.14%（42/174），其后依次為腮和腦，平均陽(yáng)性率分別為12.50%（10/80）和5.56%（7/126）。

3 討論

Chen等[7]的認(rèn)為，引起中國(guó)羅非魚嚴(yán)重鏈球菌病的主要病原由海豚鏈球菌變?yōu)闊o(wú)乳鏈球菌，而病原突然變化的確切原因目前尚不清楚，推測(cè)中國(guó)南方2008年發(fā)生的寒災(zāi)可能會(huì)對(duì)這種變化有重大影響，然而這一推斷并未得到充分證明。盡管目前鏈球菌病的主要病原為無(wú)乳鏈球菌，但海豚鏈球菌是否仍有可能恢復(fù)爆發(fā)并成為魚類疾病的風(fēng)險(xiǎn)尚不可知。本研究建立的LAMP測(cè)定方法，可特異性檢測(cè)海豚鏈球菌Sim基因，最早檢測(cè)海豚鏈球菌的時(shí)間小于30 min，同時(shí)，LAMP技術(shù)檢測(cè)Sim基因也是高度靈敏的，在純培養(yǎng)物中可檢測(cè)到最低濃度為5.32拷貝/μL的基因組DNA，比PCR方法靈敏度高100倍，這為開展海豚鏈球菌大規(guī)模調(diào)查研究提供了可能。此外，LAMP檢測(cè)不需要凝膠電泳和訓(xùn)練有素的試驗(yàn)人員，大大節(jié)省了試驗(yàn)材料和人力。

結(jié)果表明，羅非魚比所研究的其他7種魚類更易感染海豚鏈球菌。羅非魚海豚鏈球菌平均陽(yáng)性檢出率為20.40%，高于其他魚類（海魚和淡水魚）的15.53%，而來(lái)自云南的羅非魚感染海豚鏈球菌的比率在所檢測(cè)的魚類中最高，為32.91%，比羅非魚平均感染率高12.51個(gè)百分點(diǎn)。這一現(xiàn)象可能是由于2008年寒災(zāi)期間，云南省幾乎未受寒災(zāi)的影響，海豚鏈球菌存活下來(lái)的比中國(guó)南方其他地區(qū)多造成的。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，與其他時(shí)間段相比，2014年6月至9月期間海豚鏈球菌檢出率更高，而此期間中國(guó)南方地區(qū)的平均水溫為28～35 ℃，也符合鏈球菌在高溫條件下容易爆發(fā)的規(guī)律。組織分布研究結(jié)果顯示，魚類的腦和皮膚是海豚鏈球菌感染的主要部位。鑒于大腦是海豚鏈球菌的侵入點(diǎn)，因此大多數(shù)魚類在海豚鏈球菌感染后表現(xiàn)為腦膜腦炎和敗血癥[8]。

盡管目前已經(jīng)建立了3種檢測(cè)海豚鏈球菌的LAMP方法，其檢測(cè)的目的基因分別為lctO[15]、 pgm[16]和soda[17]，但尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)Sim基因并應(yīng)用于海豚鏈球菌檢測(cè)的LAMP方法。Sim基因是一種纖維蛋白原結(jié)合的M樣蛋白編碼基因，在感染海豚鏈球菌后避免宿主巨噬細(xì)胞的氧化攻擊中發(fā)揮重要作用[18]，該基因可能作為一種主要的毒力因子[19，20]，有助于抗血清殺傷和吞噬逃避[21，22]。因此，該基因的存在可能意味著存在一種感染性海豚鏈球菌。本研究采用以Sim為目的基因的LAMP測(cè)定技術(shù)，對(duì)中國(guó)南方部分魚類感染海豚鏈球菌的情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羅非魚、鱸魚、小黃魚、大黃魚、紅鯛魚、黃顙魚、鯰魚和尖吻鱸魚等都存在海豚鏈球菌感染，這意味著海豚鏈球菌可在這些魚類之間相互傳播。有研究顯示，海豚鏈球菌感染的魚類可通過(guò)糞便釋放細(xì)菌，再次感染健康的魚類[23]，或感染海豚鏈球菌死亡的魚類被用來(lái)飼喂其他魚類[3]，從而導(dǎo)致該病菌的傳播或鏈球菌病爆發(fā)。雖然本研究中未觀察到海豚鏈球菌病的爆發(fā)，但所檢測(cè)魚類及養(yǎng)殖水體較高的海豚鏈球菌攜帶率意味著這些地區(qū)的魚類仍存在較高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究建立的一種基于Sim基因的LAMP檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏、快速且成本低的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)739個(gè)樣品的檢測(cè)顯示出了良好的應(yīng)用效果，具有作為魚類海豚鏈球菌病調(diào)查應(yīng)用的良好前景。

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