河南省煙粉虱傳播的番茄病毒病分子鑒定

萬秀娟　胡京昂　李自娟　應芳卿　黃文

摘 要： 為了探究河南省番茄主產(chǎn)區(qū)是否受到煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒、番茄褪綠病毒和番茄侵染型褪綠病毒的復合侵染，采集葉片邊緣卷曲、葉片皺縮、葉脈間黃化褪綠、植株矮化的疑似煙粉虱傳播的3種病毒病的番茄植株樣品，分別用TYLCV、ToCV和TICV特異性引物對樣品進行PCR和RT-PCR檢測。結(jié)果表明，TYLCV和ToCV的特異性引物分別擴增得到約780 bp和 460 bp左右的特異性條帶，該條帶與TYLCV和ToCV陽性對照大小一致，且與這2種病毒鄭州分離物核苷酸序列同源性均在99%以上；TICV特異性引物未擴增出目的條帶。說明河南主栽區(qū)番茄受到煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒的復合侵染。

關鍵詞： 番茄；煙粉虱；病毒??；分子鑒定

Molecular identification of whitefly transmitted tomato viruses in Henan

WAN Xiujuan， HU Jingang， LI Zijuan， YING Fangqing， HUANG Wen

（Zhengzhou Vegetable Research Institute，Zhengzhou 450015， Henan， China）

Abstract： In order to explore the viruses which transmitted by whitefly， Tomato chlorosis virus （ToCV）， Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） and Tomato infectious chlorosis virus （TICV） were studied in this paper. The samples which showed symptoms of marginal curling， leaf shrinkage， interveinal chlorosis and dwarf plant were collected in the main tomato areas of Henan Province. Using specific primers of ToCV， TYLCV and TICV， ToCV， TYLCV and TICV were detected by RT-PCR and PCR. The result showed that， the specific primers of TYLCV and ToCV amplified a 780 bp specific band and a 460 bp specific band separately. The two specific bands were amplified with the same size as the positive control by the two sets of specific primers ， and the nucleotide sequence homology between these two viruses and Zhengzhou isolates was above 99%. But no bands of TICV were amplified by RT-PCR by the set of specific primers. Tomato plants were infected by both ToCV and TYLCV in the main planting areas of Henan.

Key words： Tomato； Whitefly； Virus disease； Molecular identification

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國重要的經(jīng)濟作物，在全國各地都有種植，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，種植面積逐漸增大。據(jù)報道，番茄每年春季因病毒病減產(chǎn)30%以上，夏、秋季損失更為嚴重，有的年份或地塊幾乎絕收[1-2]。近幾年，由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus disease， TYLCVD）和番茄褪綠病毒?。═omato chlorosis virus disease， ToCVD）嚴重危害番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。

煙粉虱傳播的病毒病主要有番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus， TYLCV）、番茄褪綠病毒?。═omato chlorosis virus， ToCV）和番茄侵染性褪綠病毒病（Tomato infectious chlorosis virus， TICV）。TYLCV屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。該病毒最早于1939年在以色列約旦河一帶被發(fā)現(xiàn)，1964年被正式命名，主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播，也可通過嫁接傳播，但不經(jīng)機械摩擦和種子傳毒，寄主主要有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆和煙草等[4]。番茄被TYLCV侵染后，植株生長緩慢甚至停滯，頂部葉片皺縮發(fā)黃，葉邊緣上卷。番茄植株早期感染該病毒會影響正常開花結(jié)果；后期感染則導致結(jié)果少且果實小，嚴重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，番茄黃化曲葉病毒病給世界許多地區(qū)的番茄生產(chǎn)帶來毀滅性災害[5-9]。ToCV和TICV屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus）。1998年在美國佛羅里達州首次發(fā)現(xiàn)了番茄褪綠病毒，隨后意大利、巴西、以色列、中國等地也有相繼報道[10-14]。番茄被ToCV侵染后，葉片褪綠、黃化，尤以植株下部葉片葉脈濃綠，脈間褪綠、黃化最為明顯，貌似缺素癥。在自然條件下，ToCV主要通過煙粉虱傳播，侵染茄科、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍雪科等植物，不能通過摩擦接種的方式侵染植物[15]。近年來，由于全球氣候變暖及保護地蔬菜面積增加，煙粉虱在全世界擴散與爆發(fā)，由煙粉虱傳播的番茄病毒病給番茄生產(chǎn)造成了巨大損失。目前，防治由煙粉虱傳播的番茄病毒病最有效的方法是種植抗病品種。

筆者主要通過分子生物學技術(shù)，利用TYLCV、ToCV和TICV的特異性引物，對河南省番茄主栽區(qū)的疑似樣品進行檢測，并建立一套快速的煙粉虱傳播的番茄病毒病檢測體系，為番茄病毒病的綜合防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測番茄樣品 2016年9月在鄭州、中牟、新鄭和濟源的番茄大棚中采集葉脈褪綠，葉片邊緣卷曲、皺縮、褪綠黃化的番茄葉片，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 生化試劑 RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；RTase M-MLV（RNase H-）和RNase Inhibitor購自Promega公司；Taq DNA聚合酶、凝膠回收純化試劑盒和DL2000 DNA Marker均購自杭州博日科技有限公司；dNTPs和T4 DNA Ligase 購自TaKaRa公司；其他生化試劑和化學試劑均為分析純。

1.1.3 菌株、陽性對照和克隆載體 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株與TYLCV、ToCV陽性對照由鄭州市蔬菜生物技術(shù)重點實驗室保存，克隆載體pMD18-T 購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA提取及RT-PCR 稱取番茄葉片約0.1 g加入液氮研磨成粉末，按照TRIzol法提取植物總RNA，用于cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系（10 μL）：總RNA 5.0 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ToCV和TICV下游引物ToC-6、TICVR 1.0 μL（10 μmol·L-1），RNase-Free H2O 3 μL，70 ℃變性10 min，立即冰上放置2 min，再加入5×M-MLV Buffer 5 μL，200 U·μL-1 RTase M-MLV（RNase H-）1.0 μL，40 U·μL-1 RNase Inhibitor 0.5 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL，37 ℃水浴60 min。

PCR反應體系（25 μL）如下：cDNA 5.0 μL，Taq酶 1 μL（5 U·μL-1），ToC-5/ToC-6引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 13.5 μL。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min[16]。根據(jù)Panno S等[17]報道，番茄侵染性褪綠病毒的檢測應用TICVF/TICVR特異性引物，PCR反應體系同ToCV，擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min[2，17]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照，并經(jīng)膠回收試劑盒純化后，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，陽性克隆經(jīng)驗證后送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 植物總DNA提取及TYLCV檢測 稱取0.1 g番茄葉片樣品，加入液氮充分研磨成粉末，參照 CTAB法[18]提取番茄葉片總DNA，用于后續(xù)試驗。番茄黃化曲葉病毒檢測采用TYLCV特異性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR擴增，PCR反應體系（25 μL）如下：模板DNA 1.0 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U·μL-1），TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 19 μL。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min[4]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照，并經(jīng)膠回收試劑盒純化后，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，陽性克隆經(jīng)驗證后送北京三博遠志生物技術(shù)有限公司測序。各引物序列詳見表1。

1.2.3 雙重PCR檢測ToCV和TYLCV 以ToC6反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和提取的葉片DNA為模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR為引物，進行PCR擴增。PCR反應體系：10×PCR反應緩沖液5 μL，dNTPs 1.0 μL（2.5 mmol·L-1），ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），Taq酶1.0 μL（5 U·μL-1），cDNA模板1.0 μL DNA 5.0 μL，加ddH20至體積50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，53 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min[19]。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照。

1.2.4 序列比對分析 利用NCBI序列比對工具BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析克隆獲得4個樣品的ToCV HSP70h部分序列和TYLCV CP的序列，根據(jù)相似性確定病毒種類，并與國際上報道的ToCV HSP70h與鄭州分離物（KR 150985）和TYLCV鄭州分離物（JQ 034622）進行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄疑似病株的田間表現(xiàn)

疑似復合感染ToCV和TYLCV的番茄植株，在抗TYLCV品種上表現(xiàn)為葉片沿葉脈褪綠變黃，葉片變脆，有壞死斑點等典型的ToCV癥狀；在感TYLCV品種上表現(xiàn)葉片邊緣黃化、皺縮、葉片增厚和植株矮化等典型的TYLCV癥狀。

2.2 番茄疑似病株的分子檢測

對在4個地區(qū)采集的疑似病株樣品分別提取RNA和DNA，采用ToCV和TICV的特異性引物對樣品進行RT-PCR擴增，所有樣品中，ToCV特異性引物均擴增出460 bp左右的特異性條帶，TICV特異性引物未擴增出目的條帶；采用TYLCV的特異性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR進行PCR擴增，4個地區(qū)樣品中均擴增到約780 bp左右的條帶（圖1），序列比對分析表明，4個地區(qū)樣品ToCV HSP70h和TYLCV外殼蛋白基因核苷酸序列與這2種病毒的鄭州分離物同源性均在99 %以上。結(jié)果表明，4個地區(qū)的檢測樣品均被ToCV和TYLCV復合侵染。

2.3 雙重PCR檢測ToCV和TYLCV

以ToC6反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA和提取的葉片DNA為模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR為引物，進行PCR擴增，每個樣品中均擴增得到460 bp和780 bp左右的條帶（圖2），表明采用雙重PCR可以通過1次PCR反應完成對2種煙粉虱傳播的病毒病的分子檢測。

3 討論與結(jié)論

煙粉虱是番茄黃化曲葉病毒、番茄褪綠病毒和番茄侵染性褪綠病毒的共同傳播媒介。近年來，番茄黃化曲葉病毒病已經(jīng)成為河南地區(qū)番茄產(chǎn)區(qū)的普發(fā)病害。目前，種植番茄抗病品種是控制番茄黃化曲葉病毒病最安全、有效的途徑。煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒病、番茄褪綠病毒病以及番茄黃化曲葉病毒病和番茄褪綠病毒病復合侵染的分子鑒定已有報道[2-4，14]，筆者為了提高檢測效率，通過對PCR反應體系和條件的優(yōu)化，建立了一套檢測TYLCV、ToCV和TICV 3種病毒復合侵染的方法。TICV侵染番茄后的癥狀與ToCV相似，筆者運用TICV的特異性引物對樣品進行RT-RCR，所有樣品均未擴增出目的條帶，說明樣品未受到TICV侵染，用TYLCV和ToCV特異性引物擴增，所有樣品均擴增出目的條帶，且與這2種病毒鄭州分離物的核苷酸序列同源性均在99 %以上，說明樣品均受到TYLCV和ToCV侵染。但是，在實際生產(chǎn)中種植的抗TYLCV番茄品種是否對ToCV表現(xiàn)抗病，或者是易被ToCV侵染，還需進一步研究。

TYLCV和ToCV在國內(nèi)首次報道發(fā)生以來，已經(jīng)成為國內(nèi)各個地區(qū)危害番茄生產(chǎn)的主要病害。筆者利用分子生物學技術(shù)，對河南4個地區(qū)番茄疑似該2種病毒侵染的葉片樣品進行檢測，均檢測到TYLCV和ToCV，屬于復合侵染，這也是在河南首次明確番茄受到番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒的復合侵染。

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