水禽源肺炎克雷伯菌的分離鑒定及致病性觀察

蔡雙雙 ， 劉曉麗 ， 段圣潔 ， 谷長勤 ， 程國富 ， 胡薛英

(1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 湖北宜昌443000 ; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 湖北武漢430070)

肺炎克雷伯菌是引起人類獲得性肺炎的常見致病菌，多引起新生兒呼吸道和泌尿系統(tǒng)的感染，它是一種條件致病菌，主要存在于動物和人的呼吸道以及腸道。肺炎克雷伯菌引起仔豬、牛、雞、鴨、鵝等動物的疾病報道較多，另據(jù)報道一些水生動物、水貂等野生動物[1-4]因肺炎克雷伯菌感染發(fā)病。由于肺炎克雷伯菌可以感染人和多種動物，引起多種疾病，所以對肺炎克雷伯菌的研究，無論是對疾病的控制，還是對養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和社會的公共衛(wèi)生都具有重要的意義。

本試驗通過對湖北和廣西兩地疑似感染病鴨和鵝體內(nèi)分離細(xì)菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)鑒定，并進(jìn)行了致病性動物試驗，為肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)診斷提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 湖北和廣西2地養(yǎng)殖場疑似感染病鴨和病鵝；昆明系小鼠48只，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，均購自BD公司；無支原體胎牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；抗菌藥物藥敏試紙片、腸桿菌細(xì)菌生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；蛋白酶K，購自博能生物科技有限公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，購自寶生物工程(大連)有限公司；dNTP、 Mixes、TaqDNA Polymerase，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；Gold-ViewTM，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng) 取患病動物眼瞼、心、肝、肺、腦組織，采用無菌操作方法，用接種環(huán)取病料劃線接種在TSA培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，置于37 ℃溫箱中，培養(yǎng)24～48 h后，觀察細(xì)菌生長情況。

挑取典型菌落傳代接種于TSB培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌生長情況，并取典型的單個菌落做細(xì)菌涂片，革蘭染色、鏡檢，觀察純培養(yǎng)菌的形態(tài)特征。

1.3 病原菌的生化試驗 將純化后的細(xì)菌按常規(guī)方法接種于桿菌生化試驗微量發(fā)酵管(側(cè)金花盞醇、山梨醇、硫化氫、葡萄糖酸鹽、半乳糖酸鹽、七葉苷、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、棉子糖、葡萄糖、木糖)，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.4 病原菌的16S rRNA序列測定及分析 設(shè)計并合成引物，上游引物R：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物F：5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其擴(kuò)增的預(yù)期片段大小為750 bp。

按常規(guī)方法將菌體接種于加血清的TSA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用生理鹽水收集細(xì)菌的菌體，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海天根生化科技有限公司)，按其說明書進(jìn)行基因組DNA提取。

把提取的細(xì)菌基因組DNA作為模板，采用25 μL反應(yīng)體系，條件稍有改動，Mix 12.5 μL、pw 9.5 μL、DNA模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min，94 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃90 s，共35個循環(huán)，72 ℃8 min，4 ℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，取未純化的PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 藥敏試驗 藥敏試驗采用常規(guī)紙片法操作，操作方法和試驗結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)參照所購腸桿菌科說明書。

1.6 分離菌對小鼠的致病性觀察 用滅菌生理鹽水配制分離菌的細(xì)菌濃度為2×109CFU/ mL菌懸液備用。

成年昆明系小鼠48只，經(jīng)血液檢查無細(xì)菌感染后，隨機(jī)分為8組，每組6只，試驗組1～7組經(jīng)腹腔注射途徑分別接種7株分離菌菌懸液，每只0.3 mL。對照組經(jīng)相同的途徑接種0.3 mL滅菌生理鹽水。感染后常規(guī)飼養(yǎng)管理。

感染后觀察記錄試驗小鼠的臨床癥狀、死亡時間和死亡數(shù)，對死亡的小鼠立即進(jìn)行剖檢，取心，肝部位做細(xì)菌分離鑒定，觀察死亡小鼠的病理變化。感染7 d后，對試驗小鼠全部進(jìn)行剖檢，觀察各組織臟器的病理變化并統(tǒng)計死亡數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)結(jié)果 從疑似感染病鴨和鵝的肝、心等組織中分離到細(xì)菌，經(jīng)過初步分離純化后，分離到7株細(xì)菌，分別命名為20130116DY株、20130410SK株、 20130519DY株、20130521HX株、20130521XT株、20150113MC株、20150113XY株。

7株細(xì)菌生長的營養(yǎng)要求不高，在TSA培養(yǎng)基上生長良好，可以形成直徑<1 mm的濃厚、半透明、淺白色、圓潤、凸起、表面濕潤的菌落。麥康凱培養(yǎng)基上生成紅色菌落。分離菌經(jīng)革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示,分離菌均為革蘭陰性短桿菌。

2.2 病原菌的生化試驗結(jié)果 細(xì)菌生化試驗結(jié)果顯示，側(cè)金花盞醇、山梨醇、半乳糖酸鹽、七葉苷、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、棉子糖、木糖分解為陽性；硫化氫、葡萄糖酸鹽、葡萄糖為陰性。

2.3 病原菌的PCR鑒定 將提取的菌體DNA做PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn)物均經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測。菌株擴(kuò)增出來的片段大小約750 bp。測序之后經(jīng)過BLAST分析測序與GenBank上的已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，分離細(xì)菌16S rDNA基因部分序列與克雷伯菌的同源性最高，達(dá)到99%。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 7株分離菌的藥敏試驗結(jié)果統(tǒng)計如表1。

表1 肺炎克雷伯菌的藥物敏感性檢查結(jié)果

肺炎克雷伯菌對多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物不敏感，但對于頭孢菌素保持較好的敏感性，耐藥性為25%。

2.5 分離菌對小鼠的致病性觀察結(jié)果 試驗組小鼠在接種細(xì)菌后，均表現(xiàn)精神沉郁、少飲少食、成群聚集在一起、出現(xiàn)腹式呼吸現(xiàn)象。感染12 h后開始出現(xiàn)死亡，各試驗組小鼠死亡情況統(tǒng)計見表2。

對照組小鼠精神狀態(tài)和食欲正常，被毛整潔，好動。

表2 肺炎克雷伯菌的試驗感染小鼠死亡統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

自湖北和廣西貴港兩地肉鴨養(yǎng)殖場的病鴨和病鵝的肺和肝臟中分離出7株細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特性、生化試驗及細(xì)菌16S RNA的檢查分析，鑒定該7株細(xì)菌為肺炎克雷伯菌，該菌的各種生物學(xué)特征與文獻(xiàn)報道一致[5-6]。

將分離的7株細(xì)菌經(jīng)腹腔注射途徑分別感染小鼠，感染試驗結(jié)果顯示，7菌株感染小鼠在感染后24～36 h出現(xiàn)死亡，表明這些自肉鴨和鵝的體內(nèi)分離的肺炎克雷伯菌對小鼠具有較強(qiáng)的致病性，鴨和鵝可能是攜帶者。肺炎克雷伯菌在水、土壤、農(nóng)產(chǎn)品和林產(chǎn)品中也廣泛存在，另外在海水魚、淡水魚等水產(chǎn)品中也檢測到肺炎克雷伯菌[7-8]，也是人醫(yī)醫(yī)院內(nèi)感染的常見細(xì)菌性病原[9]。提示大家應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生的管理，盡可能通過生物安全防控措施，減少和避免肺炎克雷伯菌引起感染和傳播。

因為克雷伯菌是一個條件致病菌，絕大多數(shù)動物都是攜帶者，如果免疫力低下，就可能會引起克雷伯菌乘虛而入引起感染。從本試驗藥敏結(jié)果可以看出，分離出的肺炎克雷伯菌的耐藥性也比較嚴(yán)重，一旦發(fā)病，用藥物控制難度較大，所以加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高動物機(jī)體自身的抵抗力是控制和阻斷該病傳播的關(guān)鍵。