OEPR法構建含不同破傷風毒素T細胞表位的CPB表達質(zhì)粒及其產(chǎn)物的初步鑒定

董令贏 ， 彭小兵 ， 彭國瑞 , 李旭妮 , 蔣玉文

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又名魏氏梭菌，為革蘭陽性厭氧菌，在自然界分布非常廣泛，是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人類的食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生至少 18 種毒素，且多數(shù)具有致死性，根據(jù)其所產(chǎn)生的4種主要外毒素的基因型不同，可將其分為 A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β) 、D(α、ε)及 E(α、ι)5個型[1]。β毒素是主要由B型和C型菌株產(chǎn)生的壞死、致死性毒素，可引起人和家畜的壞死性腸炎和腸毒血癥，同時，β毒素也是一種神經(jīng)性毒素，能使家畜出現(xiàn)痙攣、抽搐、角弓反張等癥狀，會對人體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴重的影響[2]。疫苗接種是目前防控產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要手段。傳統(tǒng)上，培養(yǎng) B、C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)甲醛滅活后制備疫苗，然而，近年來，該類產(chǎn)品的檢驗合格率不高已對疫苗的質(zhì)量產(chǎn)生了重要影響。據(jù)報道，對我國2006年至2014年羊三聯(lián)四防類疫苗的效力檢驗結果進行統(tǒng)計，結果以血清中和法檢驗為不符合規(guī)定的產(chǎn)品共有33批，其中C型產(chǎn)氣莢膜梭菌組分不符合規(guī)定的占21批(63.6)。由此可見，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌組分血清抗體效價不高是導致該類疫苗不符合規(guī)定的主要因素[3]，因此，研發(fā)新型安全有效的疫苗已成為當前亟待解決的問題。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，基因工程亞單位疫苗，因其具有安全性高、成本低等優(yōu)點，已逐漸被廣泛應用。但是某些基因工程亞單位疫苗的免疫原性較弱，不能被抗原提呈細胞有效識別、提呈，這是限制亞單位疫苗開發(fā)和應用的一個亟待解決的問題[4]。破傷風毒素T 細胞表位屬于外源性通用 Th 細胞表位，能泛特異性地結合MHCⅡ類分子，將其插入多肽抗原或半抗原中，能有效提高抗原的免疫原性[5]。據(jù)報道，可直接將多個T細胞表位相連得到串聯(lián)的多肽表位，各表位之間以柔性linker連接以防止新的抗原表位形成。此連接法可以有效地增強抗原多肽表位的免疫原性[6]。因此，本研究將破傷風毒素輔助性T細胞表位P2 、P21-P30-P2 、P32-P23-P21-P30-P2引入蛋白前，用OEPR法分別構建到pCold pros2和pET22(+)載體中，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達重組蛋白，SDS-PAGE分析蛋白的表達形式，Western Blotting檢測其免疫原性，為后續(xù)評價破傷風毒素輔助T細胞表位對β毒素免疫原性的影響及亞單位疫苗的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種 pCold ProS2、pET22b(+)質(zhì)粒由本實驗室保存；Trans1-T1 、BL21(DE3)感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術有限公司；Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，購自天根生化科技(北京)有限公司；pEZ-clone為含P32-P23-P21-P30-P2-cpb全基因序列的重組質(zhì)粒由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成(P2、P21、P23、P30、P32均為破傷風毒素輔助性T細胞表位，其氨基酸序列分別為：P2 QYIKANSKFIGITE；P21 IREDNNITLKLDRCNN；P23 VSIDKFRIFCKANPK；P30 FNNFTVSFWLRVPKVVSASHLE；P32 LKFIIKRYTPNNEIDS。cpb為密碼子優(yōu)化后的β毒素基因)。

1.2 培養(yǎng)基 LB瓊脂、LB肉湯，均購自北京中海生物科技有限公司；自誘導培養(yǎng)基參照文獻[7]配制；氨芐青霉素，購自生工生物工程(上海)技術服務有限公司。

1.3 主要試劑 質(zhì)粒小量提取試劑盒、DMT酶，購自北京全式金生物技術有限公司；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix、2×A9 LongHiFi PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自北京艾德萊生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG，購自北京康為世紀生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；BugBuster Protein Extraction Reagent，購自Novagen公司；核糖核酸酶A、溶菌酶，購自生工生物工程(上海)技術服務有限公司。

1.4 試驗用動物 CD-1(ICR)小鼠，體重16～18 g，SPF級；購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.5 方法

1.5.1 引物設計與合成 依據(jù)OEPR法原理，利用Primer 5.0軟件進行引物設計，見表1、2。

表1 用于構建含不同破傷風毒素T細胞表位的pCold重組質(zhì)粒的引物

表2 用于構建含不同破傷風毒素T細胞表位的pET22b重組質(zhì)粒的引物

1.5.2 含T細胞表位的β毒素目的片段的擴增 用于構建到pCold proS2載體上目的片段的擴增體系：模板(pEZ-clone質(zhì)粒)1 μL，上游引物(F-C1或F-C2或F-C3或F-C4) 1 μL，下游引物(R-C)1 μL， 2×A8 Master Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃熱變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min。

用于構建到pET22b載體上目的片段的擴增體系：模板(pEZ-clone質(zhì)粒)1 μL，上游引物(F-E1或F-E2或F-E3或F-E4) 1 μL，下游引物(R-E)1 μL， 2× A8 Master Mix 25 μL，ddH2O 22 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃熱變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

以上兩組擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增得到的目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。

1.5.3 pCold-CPB系列質(zhì)粒和pET22b-CPB系列質(zhì)粒的構建 pCold-CPB系列質(zhì)粒構建體系：模板(pCold空質(zhì)粒)0.3 μL，用于pCold proS2載體構建的目的片段 各2.5 μL，2×A9 Master Mix 12.5 μL，R-pCold 0.5 μL，ddH2O 9.7 μL。反應條件：98 ℃預變性3 min，95 ℃熱變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸180 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

pET22b-CPB系列質(zhì)粒構建體系：模板(pET22b空質(zhì)粒)0.2 μL，用于pET22b(+)載體構建的目的片段 各11.8 μL，2×A9 Master Mix 12.5 μL，R-pET22b 0.5 μL。反應條件：98 ℃預變性3 min，95 ℃熱變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸240 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

以上兩組構建產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.4 轉(zhuǎn)化 向pCold-CPB及pET22b-CPB系列質(zhì)粒構建產(chǎn)物，加入DMT酶于37 ℃過夜消化，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素的平板。

1.5.5 質(zhì)粒的測序鑒定 取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，以載體上游通用引物(pCold ProS2-F2 primer或T7 promoter primer)及cpb基因的反向引物(R-C或R-E)進行PCR鑒定，將鑒定結果陽性的質(zhì)粒送交中美泰和生物(北京)有限公司測序鑒定。

1.5.6 重組蛋白在大腸桿菌中的表達 將鑒定陽性的重組質(zhì)粒pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB及空質(zhì)粒pCold轉(zhuǎn)化BL21(DE)感受態(tài)細胞；將鑒定陽性的重組質(zhì)粒pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB及空質(zhì)粒pET22b轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞。對以上重組菌進行誘導表達。分別挑取陽性重組菌和空載體對照菌的單菌落，于自誘導培養(yǎng)基中，25 ℃誘導28 h。SDS-PAGE鑒定重組蛋白是否表達，并分析其表達形式。

1.5.7 Western Blot檢測 蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF硝酸纖維素膜上，以C型產(chǎn)氣莢膜梭菌兔抗血清為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG抗體為二抗，進行Western Blot 檢測。

1.5.8 毒性試驗 將誘導表達的各重組菌液，0.2 mL/只，腹腔注射16～18 g ICR小鼠，每組2只。同時設pCold proS2在E.coliBL21(DE3)、pET22b(+)在Rosetta(DE3)誘導后菌液為對照組，觀察72 h，記錄死亡情況。

2 結果

2.1 含T細胞表位的β毒素基因片段擴增 以pEZ-clone質(zhì)粒為模板擴增出含有相應載體同源臂的cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-cpb、P32-P23-P21-P30-P2-cpb片段，大小分為991 bp、1 033 bp、1 143 bp、1 252 bp與預期大小一致(見圖1和圖2)。

圖1 用于pCold載體的CPB片段的擴增結果

M: DNA MarkerⅡ； 1、2、3、4：cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-CPB、P32-P23-P21-P30-P2-cpb的PCR產(chǎn)物

圖2 用于pET22b載體的CPB片段的擴增結果

M: DNA MarkerⅡ； 1、2、3、4：cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-CPB、P32-P23-P21-P30-P2-cpb的PCR產(chǎn)物

2.2 構建pCold-CPB和pET22b-CPB系列質(zhì)粒 采用OEPR法分別以pCold和pET22b空質(zhì)粒為模板，利用R-pCold或R-pET22b引物，將含不同T細胞表位的CPB片段克隆至pCold及pET22b載體上，獲得重組表達質(zhì)粒。pCold系列質(zhì)粒大小約6 000 bp，pET22b系列質(zhì)粒大小約6 400 bp，核酸電泳結果如圖3和圖4，與預期大小一致。

2.3 質(zhì)粒測序結果 分析測序峰圖可見目的片段cpb、P2-cpb、P21-P30-P2-cpb、P32-P23-P21-P30-P2-cpb分別成功構建至pCold及pET22b載體，中插彩版圖5至圖12為重組質(zhì)粒上目的片段與載體連接處峰圖測序結果，表明使用OEPR法成功構建以上8個重組質(zhì)粒。8個重組質(zhì)粒的測序結果與預期序列的同源性均為100%，并且閱讀框均未發(fā)生移碼。

圖3 pCold-CPB系列質(zhì)粒構建結果

M:DL-15 000 DNA Marker； 1、2、3、4：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

圖4 pET22b-CPB系列質(zhì)粒構建結果

M:DL-15 000 DNA Marker； 1、2、3、4：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

2.4 重組蛋白在大腸桿菌中的表達 重組菌經(jīng)BugBuster蛋白抽提試劑、核糖核酸酶A及溶菌酶破碎處理后，進行SDS-PAGE分析。pCold-CPB(60 kDa)、pCold-P2-CPB(62 kDa)、pCold-P21-P30-P2-CPB(66 kDa)、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB(70 kDa)重組蛋白在BL21(DE3)中成功表達；pET22b-CPB(40 kDa)、pET22b-P2-CPB(41 kDa)、pET22b-P21-P30-P2-CPB(46 kDa)、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB(50 kDa)重組蛋白在Rosetta(DE3)中成功表達，蛋白大小與預期一致(圖13和圖14)，在pET22b載體中，重組蛋白的表達形式均為包涵體；在pCold載體中，重組蛋白的大部分以包涵體形式表達，pCold-CPB、pCold-P2-CPB部分以可溶形式表達。

圖13 重組蛋白表達的SDS-PAGE分析

M:蛋白分子量Marker； 1：BL21(DE3)(pCold pro S2)未誘導； 2：BL21(DE3)(pCold pro S2)誘導后； 3、5、7、9：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB誘導后菌體裂解上清； 4、6、8、10：pCold-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB誘導后菌體裂解沉淀

圖14 重組蛋白表達的SDS-PAGE分析

M：蛋白分子量Marker； 1、3、5、7：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB誘導后菌體裂解上清； 2、4、6、8：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB誘導后菌體裂解沉淀

2.5 重組蛋白的Western Blot分析 免疫印跡結果表明，pET22b系列質(zhì)粒、pCold系列質(zhì)粒分別在預期大小出現(xiàn)明顯的條帶(圖15和圖16)，說明重組蛋白具有良好的反應原性。

2.6 毒性試驗 在72 h內(nèi)，對照組均未死亡。每組注射了重組菌液的小鼠均2/2死亡，表明以上8種蛋白均具備毒性。

圖15 pET22b-CPB免疫印跡結果

M:蛋白分子量Marker； 1、2、3、4：pET22b-CPB、pET22b-P2-CPB、pET22b-P21-P30-P2-CPB、pET22b-P32-P23-P21-P30-P2-CPB

圖16 pCold-CPB免疫印跡結果

M:蛋白分子量Marker； 1、2、3、4：pCold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB、pCold-P21-P30-P2-CPB、pCold-P2-CPB、pCold-CPB； 5：pCold proS2 BL21(DE3)未誘導； 6：pCold proS2 BL21(DE3)誘導后

3 討論

目前，構建重組質(zhì)粒的方法主要有3種：(1)雙酶切法，將目的片段、載體分別雙酶切后，連接，這種方法不僅費時費力，而且成功率很低；(2)無縫克隆法，此法是利用同源重組酶及同源重組臂將DNA片段克隆至載體，現(xiàn)常用此法，但是此法對含二級結構及其他復雜結構的質(zhì)粒構建較困難；(3)以PCR延伸為基礎的克隆方法，如RF(Restriction-free) cloning、EMP(Exponential Megapriming PCR)等，RF cloning法可直接、有效的將目的片段連接到靶載體上，但是當目的片段大于1 kb時，此方法克隆的效率會大大降低[8]；EMP法引入了一條反向引物，這提高了連接的效率，但是該法第二輪PCR后產(chǎn)物的磷酸化和連接，增加了勞動和經(jīng)濟成本[9]。筆者多次采用無縫克隆法構建pCold系列質(zhì)粒，始終無法成功，經(jīng)分析pro S2中含有兩個幾乎完全重復的序列，進而可能形成高級結構導致無縫克隆法構建失敗。故，本實驗選用OEPR法構建重組質(zhì)粒，OEPR法是一種不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段酶切位點限制的克隆方法，該法是基于重疊延伸PCR及體內(nèi)重組的一種有效的大DNA片段克隆的方法。利用該克隆技術，可以很容易地將1～6 kb的長片段或同時將2～4個片段組裝到目標載體上。與傳統(tǒng)的克隆方法相比，OEPR克隆法對插入長片段和組裝多個片段是更有效和更經(jīng)濟的方法[10]。本試驗選用同源臂的長度為24 bp，Tm值為69 ℃，均成功高效地構建出8個重組質(zhì)粒。

本研究中使用的P32、P23、P21、P30、P2均來源于破傷風毒素氨，均為通用CD4+輔助性T細胞表位。將其加入弱免疫原性的多肽抗原或半抗原后, 可以泛特異性地結合MHC Ⅱ類分子，進而使B細胞活化、增殖，進而分泌高水平抗體，從而有效提高多肽抗原或半抗原的免疫原性[11]。利用輔助性T細胞表位增強亞單位疫苗免疫原性的研究有很多。如2006年，Nina在惡性瘧原蟲B細胞表位抗原肽上引入包括破傷風毒素的T細胞表位P2等4種不同的T細胞表位，將其免疫C57BL/6和BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)T細胞表位不僅能增強小鼠的體液免疫，還能提高其細胞免疫水平[12]。2013年，李國新合成了含有豬瘟病毒 E2 蛋白線性中和表位的短肽B，合成了含有通用型輔助性T細胞表位的短肽 Th-B。將上述2種合成肽與弗氏佐劑混合乳化后，免疫兔子，并用豬瘟弱毒對免疫兔子進行攻擊，比較抗原肽的免疫保護效果。結果顯示，通用型輔助性 T 細胞表位增強了短肽抗原的免疫原性[13]。2016年，聞曉波構建了豬輪狀病毒SB-1A株截短的 VP8＊蛋白原核表達載體 pET28a-SB-1A△VP8＊，將破傷風毒素的通用T細胞表位P2引入重組亞單位蛋白，構建重組載體 pET28a-P2-SB-1A△VP8＊。分別將以上兩種重組蛋白與氫氧化鋁佐劑混合后經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠，利用間接ELISA法檢測免疫小鼠的血清抗體水平。結果顯示， 重組蛋白P2-SB-1A△VP8＊誘導的血清抗體水平顯著高于SB-1A△VP8＊，說明P2 可以增強 SB-1A△VP8＊的免疫原性[3]。 基于以上研究報道，本研究將P2、P21-P30-P2、P32-P23-P21-P30-P2 分別與CPB蛋白串聯(lián)，以期增強β毒素蛋白的免疫原性。

本研究成功構建了含破傷風毒素T細胞表位的產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素重組質(zhì)粒，免疫印跡試驗證實了其具有良好的反應原性，至于T細胞表位對β毒素的免疫原性是否有促進作用仍需后續(xù)的動物實驗來證實。本研究為產(chǎn)氣莢膜梭菌重組毒素亞單位疫苗的開發(fā)提供了新思路。