星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化膏方煎煮工藝

朱 亮，王群星，王秀敏，顏 梅，徐菲拉#

(1.金華市中心醫(yī)院中藥房，浙江 金華 321000； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

膏方具有滋補(bǔ)、預(yù)防及治療疾病等作用，是針對(duì)人的體質(zhì)、臨床表現(xiàn)而擬定的復(fù)方湯劑經(jīng)反復(fù)煎煮濃縮后加入特定的輔料制成的半流質(zhì)劑型，為中醫(yī)藥八大劑型之一[1]。出膏率是指按照規(guī)定的煎煮工藝生產(chǎn)，100單位質(zhì)量的中藥材所產(chǎn)出的流浸膏或干浸膏的質(zhì)量，與膏方的質(zhì)量和成本關(guān)系密切，為中藥生產(chǎn)過程中的重要參數(shù)[2]。膏方的煎煮工藝對(duì)出膏率具有極大影響，容易造成中藥膏方質(zhì)量的差異，直接影響其臨床療效[3]。優(yōu)選中藥煎煮工藝的方法主要包括正交設(shè)計(jì)法、均勻設(shè)計(jì)法和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法(central composite design，CCD)。CCD法可通過模型擬合描繪三維效應(yīng)面，從較優(yōu)區(qū)域直接讀取較優(yōu)工藝條件，具有高精度、少試驗(yàn)等特點(diǎn)[4-6]。因此，本研究通過引入CCD法，選取金華市中心醫(yī)院(以下簡稱“我院”)中藥膏方處方中不同入藥部位的常用藥材作為考察對(duì)象，以出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察膏方煎煮工藝，優(yōu)選較優(yōu)條件，以期為CCD法應(yīng)用于膏方煎煮工藝提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5203(上海亞榮生化儀器廠)；JZY-10型電動(dòng)煎煮機(jī)、不銹鋼煎煮鍋(天津三延精密器械有限公司)；BT25S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海頓克儀器科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑

制備膏方所需的藥材購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，均為《中華人民共和國藥典》(2015年版)收載品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方擬定

取我院膏方制備常用藥材，按不同來源各稱取5 g，其中根及根莖類：首烏、牛膝、炒白術(shù)、炒白芍、甘草、黃芪、熟地、麥冬及山藥；皮類：瓜蔞皮、合歡皮、地骨皮、厚樸、杜仲、陳皮、黃柏及桑白皮；花類：玫瑰花、綠梅花、菊花、金銀花及款冬花；種子果實(shí)類：女貞子、菟絲子、柏子仁、酸棗仁、五味子、山茱萸及車前子；全草類：寄生、淫羊藿、白花蛇舌草、益母草、蒲公英、石斛及仙鶴草，混合備用。

2.2 出膏率測定方法

將總煎煮液通過預(yù)先稱定質(zhì)量的微孔濾膜。過濾后，取出濾膜，并移置真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，濾膜所增加的質(zhì)量即為不溶物質(zhì)量(M4)。稱定濃縮液總質(zhì)量(M1)，稱取濃縮液供試品(M2)約5 g，置于已稱定質(zhì)量的蒸發(fā)皿，在水浴上干燥至浸膏，并移置真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，得供試品干質(zhì)量(M3)，按公式(1)[出膏率(%)=(M1/M2)×(M3-M4)/處方投料量×100%]計(jì)算即得[7]。

2.3 單因素分析

2.3.1 冷浸時(shí)間考察：稱取膏方藥材5份，用10倍量水分別浸泡0.5、2、4、6及12 h，濾出水分，并測定濾出水分體積，計(jì)算吸水率，按公式(2){藥材吸水率(%)=[吸水后藥材質(zhì)量(g)-吸水前藥材質(zhì)量(g)]×100%/吸水前藥材重量(g)}計(jì)算即得[8]，測定各個(gè)時(shí)間段的吸水率分別為40.82%、78.57%、92.86%、102.97%及104.00%。結(jié)果表明，隨著冷浸時(shí)間的增加，吸水率隨之增長，在6 h后吸水率基本不再增長，結(jié)合膏方制作周期，故冷浸時(shí)間以6 h為考察對(duì)象。

2.3.2 煎煮次數(shù)考察：稱取膏方藥材5份，稱定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮時(shí)間2 h，分別煎煮1、2、3、4及5次，測定出膏率分別為17.5%、32.1%、42.8%、43.8%及45.6%。結(jié)果表明，隨著煎煮次數(shù)增加，出膏率也增長，煎煮2次后，出膏率增長已較為平緩，故煎煮次數(shù)以2次左右為考察對(duì)象。

2.3.3 煎煮時(shí)間考察：稱取膏方藥5份，稱定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮2次，煎煮時(shí)間分別為0.5、1、2、3及4 h，合并濾液，測定出膏率分別為19.0%、32.0%、44.3%、43.5%及43.4%。結(jié)果表明，煎煮2 h出膏率最高，且隨著煎煮時(shí)間的增加，出膏率變化不顯著，故選擇煎煮時(shí)間為2 h。

2.3.4 料液比考察：稱取膏方藥5份，稱定，分別加入水1 080、1 440、1 800、2 160及2 520 ml(即料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12及1∶14)，浸泡6 h后煎煮2 h，各煎煮2次，合并濾液，測定出膏率分別為19.0%、32.2%、45.1%、44.3%及44.1%。結(jié)果表明，料液比為1∶10時(shí)出膏率達(dá)到峰值后無顯著性變化。

2.4 膏方藥材煎煮工藝優(yōu)化

2.4.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果：以煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間和料液比為考察因素，但煎煮次數(shù)為非連續(xù)變量難于作回歸處理，因此結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)的實(shí)際，將煎煮次數(shù)固定為2次。選擇煎煮時(shí)間(X1)和料液比(X2)為考察因素，以浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)做二因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，各因素設(shè)5個(gè)水平，用代碼-a、-1、0、+1、a來表示。對(duì)于二因素星點(diǎn)設(shè)計(jì)a=1.414[9]。設(shè)定X1范圍： 0.5～3.5 h；X2范圍：6～14倍。試驗(yàn)因素水平、安排及結(jié)果分別見表1—2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Tab 1 Central composite design/response surface methodology level

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果Tab 2 Arrangements and results of central composite design/response surface methodology

試驗(yàn)?zāi)Ｐ屯ㄟ^最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式方程可以表達(dá)為：Y=b0+b1Xl+b2X2+b3X1X2+b4X12+b5X22。其中Y為效應(yīng)值(出膏率)，r為二項(xiàng)式模型方程擬合度系數(shù)，其顯著性由F值檢驗(yàn)。

2.4.2 煎煮工藝優(yōu)化結(jié)果分析：由design-expert 8.0得到星點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3；效應(yīng)面法對(duì)浸膏得率分析結(jié)果見圖1—2。由圖1可知，取值較小時(shí)，效應(yīng)面較陡，說明此時(shí)煎煮時(shí)間和料液比的改變對(duì)出膏率的影響較明顯。隨著因素取值增大，效應(yīng)面趨向于平緩，提示此時(shí)煎煮時(shí)間和料液比的改變對(duì)出膏率的影響不顯著。

圖1 提取時(shí)間和料液比對(duì)出膏率影響等高線圖Fig 1 Contour map of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

2.4.3 模型擬合：模型擬合的目的就是用數(shù)學(xué)模型來近似擬合函數(shù)，當(dāng)其接近到一定可信程度，就可以用于分析和優(yōu)化操作。模型擬合的結(jié)果優(yōu)劣可以用方差分析來進(jìn)行判斷[10]。二項(xiàng)式擬合公式：Y=-63.84+26.51A+13.31B-5.41A2-0.56B2(r=0.917，P<0.01)。方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，該模型擬合度較好，可用于預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。回歸模型系數(shù)顯著性結(jié)果表明：液料比、煎煮時(shí)間的平方對(duì)膏方得率的影響極顯著；料液比的平方及煎煮時(shí)間對(duì)膏方得率的影響顯著。結(jié)合較優(yōu)模型結(jié)果，各因素對(duì)膏方得率影響的顯著性由大到小為液料比>煎煮時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間和料液比對(duì)出膏率影響3D效應(yīng)圖Fig 2 3D diagram of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

表3 膏方藥材煎煮工藝星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results of water extraction by central composite design/response surface methodology

表4 二次回歸模型方差分析結(jié)果Tab 4 Quadratic regression model analysis of variance

注：**P<0.01，*P<0.05

2.4.4 效應(yīng)面優(yōu)化和驗(yàn)證：根據(jù)自變量較優(yōu)預(yù)測范圍，選取的工藝條件為11.8倍量水，煎煮2.4 h，根據(jù)所得的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的出膏率平均為46.07%，RSD為1.43%。各考察指標(biāo)與預(yù)測值相比較，偏差都較小，見表5；表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，本工藝為煎煮工藝條件所得的出膏率較穩(wěn)定，驗(yàn)證該工藝可行。

3 討論

膏方在中醫(yī)藥防治疾病中起著重要的作用[11]。隨著中醫(yī)“治未病”預(yù)防保健工作的開展和個(gè)體化膏方的興起，膏方業(yè)務(wù)在各大醫(yī)院和藥店迅猛發(fā)展[12]。但中藥膏方的煎煮工藝存在藥材浪費(fèi)嚴(yán)重、工藝復(fù)雜及制備耗時(shí)長等問題，其粗放的制作工藝可能會(huì)直接影響臨床療效。相關(guān)文獻(xiàn)多采用正交試驗(yàn)優(yōu)選膏方煎煮工藝[13]，但該法采用線性數(shù)學(xué)模型，精度不高且無法精確找到最佳點(diǎn)，條件優(yōu)選僅憑經(jīng)驗(yàn)，無法考察各因素間的相互作用等。星點(diǎn)設(shè)計(jì)則是采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，是集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的研究方法，通過模型擬合構(gòu)建的三維效應(yīng)面上直接讀取較優(yōu)工藝條件，可在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，具有提高實(shí)驗(yàn)的精度、減少試驗(yàn)等特點(diǎn)，已逐步應(yīng)用于中藥提取分離工藝的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析[14-15]。

表5 膏方煎煮工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Verification test results of paste decoction process

本研究通過引入星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)煎煮工藝作精細(xì)篩選，以出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素在膏方煎煮過程中的變化趨勢，繪制效應(yīng)面圖，實(shí)現(xiàn)工藝優(yōu)選。本研究結(jié)果顯示，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)膏方煎煮工藝優(yōu)化所得結(jié)果更加直觀，便于分析，提高了試驗(yàn)精度。采用非線性模型擬合，各項(xiàng)系數(shù)的P均<0.05，復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.917 0，提示試驗(yàn)所得的模擬方程是可信的，兩個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響都是顯著，可對(duì)膏方煎煮工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。經(jīng)驗(yàn)證，預(yù)測值與真實(shí)值接近，其相對(duì)誤差為3.34%(n=3)，確定膏方煎煮工藝為用11.8倍量水煎煮2次，每次煎煮2.4 h，出膏率為46.07%(n=3，RSD=1.43%)，提示星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化膏方煎煮工藝準(zhǔn)確可行，適宜作為篩選中藥煎煮工藝參數(shù)研究的試驗(yàn)方法。

出膏率是評(píng)價(jià)膏方煎煮工藝的基本指標(biāo)，將其控制在合理的范圍內(nèi)具有一定的意義，但難以滿足膏方質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化[16]。因此，膏方研究將不斷深入，在規(guī)范膏方制備工藝的基礎(chǔ)上，既遵循傳統(tǒng)加工理念又引入現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，通過研究包括外觀、口感、流動(dòng)性、黏度及水溶性等膏方成型性指標(biāo)和指紋圖譜等分析手段，制定精確、全面且可控的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期構(gòu)建科學(xué)合理化的膏方制備工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。