內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓中的作用*

張晶晶， CHEN Jun-hao， 趙美平， 武垣伶， 張聰聰， 應(yīng) 磊， 陳錫文， 王萬鐵△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 浙江 溫州 325035； 2. School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, Perth 6000, Australia； 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 浙江 溫州 325035)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一種肺血管選擇性重塑疾病，預(yù)后極差。肺血管壁內(nèi)的細(xì)胞，包括肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)，具有增殖和凋亡的特點(diǎn)，可引起肺動(dòng)脈重塑，堵塞血管腔，導(dǎo)致右心衰竭和過早死亡。觸發(fā)或促進(jìn)PAH過程的一個(gè)共同特征是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1]。CHOP、JNK和caspase-12是與ERS通路相關(guān)的三個(gè)主要凋亡基因，而GRP78的急速上調(diào)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最敏感的標(biāo)志[2]。有研究表明[3]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受缺氧的影響引起ERS，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓，但其是否參與低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展，目前尚未見研究報(bào)道。本研究將4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)和衣霉素(tunicamycin，TM)分別作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的抑制劑和激動(dòng)劑，用來干預(yù)低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓模型，探討ERS通路在低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓中的作用及其機(jī)制，以期為肺動(dòng)脈高壓的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠40只，清潔級(jí)，體重(200±20)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(浙)2015-0009。

1.2 試劑和儀器

4-PBA，TM(Sigma，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國)，兔抗大鼠GRP78抗體，兔抗大鼠JNK抗體，兔抗大鼠p-JNK抗體，兔抗大鼠caspase-12抗體(Abcam，英國)，小鼠抗大鼠CHOP抗體(CST，美國)，RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。Power Lab生物信息采集系統(tǒng)(AD Instruments，澳大利亞)，PE導(dǎo)管(0.90 mm×0.50 mm，澳大利亞)，真空冷凍干燥機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，顯微鏡(Nikon，日本)，紫外分光光度計(jì)(Ultrospec 2100pro Amersham BioSciences，美國)，PCR熱循環(huán)儀(LifePro，杭州博日科技有限公司)，電熱恒溫水溫箱(上海賀德試驗(yàn)設(shè)備廠)，雪花制冰機(jī)(北京長流科學(xué)儀器公司)，UV-800全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠)，蛋白電泳/轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型的制備

將40只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為四組，即常氧對(duì)照組(N)、低氧高二氧化碳組(HH)、ERS抑制劑組(4-PBA)、ERS激動(dòng)劑組(TM)，n=10。N組置于常氧環(huán)境下飼養(yǎng)。HH組、4-PBA組、TM組按參考文獻(xiàn)[3]方法制備低O2高CO2模型，三組大鼠均置于常壓低氧高二氧化碳氧艙中，艙內(nèi)氧濃度維持在9%～11%，二氧化碳濃度維持在5%～6%(艙內(nèi)水蒸氣用無水CaCl2吸收，二氧化碳用氫氧化鈣吸收)，每天暴露8 h，每周6 d，飼養(yǎng)4周。4-PBA組大鼠在進(jìn)艙前半小時(shí)腹腔注射用生理鹽水溶解的4-PBA，用量為80 mg/kg，每周6次，共4周。TM組進(jìn)艙前半小時(shí)腹腔注射用生理鹽水稀釋的TM，用量為0.08 mg/kg，每周2次，共4周。HH組進(jìn)艙前半小時(shí)腹腔注射等量的生理鹽水。其他飼養(yǎng)條件各組均相同。

1.4 大鼠肺動(dòng)脈平均壓、頸動(dòng)脈平均壓和右心室肥大指數(shù)的測定

4周后，用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉大鼠，利用Power Lab生物信息采集系統(tǒng)采用右心導(dǎo)管法檢測大鼠肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)和頸動(dòng)脈平均壓(mean carotid artery pressure，mCAP)。然后用生理鹽水灌洗大鼠，剪下大鼠心臟及肺，分離大鼠右心室游離壁；稱取右心室游離壁重量(RV)及左心室加心室間隔重量(LV+S)，按下式計(jì)算右心室肥大指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)：RVHI=RV/(LV+S)，用于判斷右心室肥厚程度。

1.5 免疫熒光α-SMA標(biāo)記法鑒定大鼠肺中小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

取各組大鼠右肺中葉，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片(厚度約4 μm)，采用免疫熒光法觀察肺中小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)。加兔抗大鼠α-SMA單克隆抗體(稀釋1∶100)在4℃孵育過夜，用TRITC標(biāo)記的二抗(稀釋1∶100)在37℃避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察外徑(30～150) μm的中小動(dòng)脈并拍片。

1.6 電鏡觀察肺組織及肺中小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

大鼠灌注后迅速取出肺組織，置于蠟板上，滴加2.5%戊二醛固定液，各大鼠隨機(jī)留取右上肺靠近肺門處1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織4～6片，再浸入2.5%戊二醛固定液中置4℃冰箱內(nèi)固定2 h以上，依次經(jīng)1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑包埋聚合，半薄切片光鏡定位于肺中小動(dòng)脈并超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察并拍照。

1.7 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)

采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)按試劑盒說明書進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下正常肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色，凋亡肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的胞核呈棕褐色。每組隨機(jī)取5張切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=肺動(dòng)脈中的陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 RT-PCR檢測大鼠ERS相關(guān)mRNA表達(dá)

將大鼠肺組織充分勻漿，采用Trizol法提取總RNA，測吸光度(A)值，計(jì)算RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)：(1)GRP78：上游引物5’-GGCGTGAGGTAGAAAAGG-3’，下游引物5’-ATGGTAGAGCGGAACAGG-3’(產(chǎn)物為151 bp)；(2)JNK：上游引物5’-GATTCTTGATTTTGGACTGG-3’，下游引物5’-TGACCTCTGGTGCTCTGT-3’ (產(chǎn)物為92 bp)；(3)caspase-12：上游引物5’-CCACAAGCAAAGGGATAG-3’，下游引物5’-GGAAATGAAGAGAGAGCCA -3’ (產(chǎn)物為173 bp)；(4)CHOP：上游引物5’-AGCAGAGGTCACAAGCACCT-3’，下游引物5’-CTCCTTCATGCGCTGTTTCC-3’(產(chǎn)物為157 bp)；(5)β-actin：上游引物5’-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3’，下游引物5’-TGGAAGGTGGACAGTGAG -3’(產(chǎn)物為201 bp)。擴(kuò)增后電泳，用UV-800全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)曝光成像，Quantity One軟件分析電泳條帶灰度值，用目的基因與β-actin基因灰度值之比表示目的基因的表達(dá)水平。

1.9 Western blot檢測大鼠ERS相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)

將大鼠肺組織充分勻漿，裂解30 min后，12 000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。以10%膠濃度作SDS-PAGE分離，濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。用一抗稀釋液稀釋抗GRP78抗體(1∶1 000)、抗caspase-12抗體(1∶1 000)、抗p-JNK抗體(1∶1 000)、抗JNK抗體(1∶2 000)、抗CHOP抗體(1∶1 000)，抗GAPDH抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜。GRP78、caspase-12、p-JNK、JNK和GAPDH用山羊抗兔IgG，CHOP用山羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h，所用二抗稀釋比例均為1∶10 000。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色后，于曝光儀曝光并保存。用Quantity One軟件分析條帶灰度值，GRP78、caspase-12、CHOP用目的蛋白與GAPDH蛋白質(zhì)灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平，JNK用目的蛋白與p-JNK蛋白質(zhì)灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺動(dòng)脈平均壓、頸動(dòng)脈平均壓及右心室肥大指數(shù)的比較

與N組相比，HH組、4-PBA組、TM組肺動(dòng)脈平均壓和右心室肥大指數(shù)均明顯上升(P<0.01)。與HH組相比，4-PBA組肺動(dòng)脈平均壓與右心室肥大指數(shù)降低(P<0.01)；TM組肺動(dòng)脈平均壓和右心室肥大指數(shù)升高(P<0.05，P<0.01)。各組頸動(dòng)脈平均壓力值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。

GroupmPAP(mmHg)mCAP(mmHg)RV/(LV+S)(%)N15.37±1.65112.58±3.9424.09±1.89HH28.74±2.89**110.37±3.8532.89±2.28**4-PBA23.63±2.34**##111.31±3.2728.57±2.13**##TM31.88±4.63**#110.85±4.5135.66±1.97**##

mPAP： Mean pulmonary artery pressure； mCAP： Mean carotid artery pressure； RV： Weight of right ventricle； LV+S： Weight of left ventricle and septal； N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

**P<0.01vsN group；#P<0.05,##P<0.01vsHH group

2.2 各組大鼠肺中小動(dòng)脈免疫熒光圖

圖中紅色熒光標(biāo)記的是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。與N組相比，HH組、4-PBA組、TM組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均有增殖，管壁厚度增大(WA/TA，P<0.01)，管腔面積縮小(LA/TA，P<0.01)；與HH組相比，ERS抑制劑4-PBA組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖被抑制，WA/TA值減小、LA/TA值增大(P<0.01)；與HH組相比，ERS激動(dòng)劑TM組肺動(dòng)脈平滑肌層增厚，WA/TA值增大、LA/TA值減小(P<0.01，表2，圖1，圖1見彩圖頁Ⅲ)。

GroupWA/TA(%)LA/TA(%)N31.48±6.8368.52±6.83HH62.71±5.42**37.29±5.42**4-PBA47.96±5.31**##52.04±5.31**##TM78.16±4.64**##21.84±4.60**##

WA： Pulmonary artery wall area； TA： Total area of pulmonary artery； LA： Luminal area of pulmonary artery； N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

**P<0.01vsN group；##P<0.01vsHH group

2.3 各組大鼠肺組織透射電鏡觀察結(jié)果

電鏡下，N組大鼠肺動(dòng)脈基底膜上內(nèi)皮細(xì)胞扁平緊緊粘附，微絨毛突起出現(xiàn)于細(xì)胞的游離面；平滑肌細(xì)胞胞體小，胞漿均勻，細(xì)胞器無異常。HH組大鼠肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，出現(xiàn)壞死脫落；平滑肌細(xì)胞肥厚，胞漿內(nèi)可見大量空泡、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。4-PBA組大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，微絨毛消失，細(xì)胞向血管腔內(nèi)突起，空泡減少，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有少許腫脹，平滑肌細(xì)胞處于收縮表型；TM組大鼠肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯，肺泡間隔的血管壁內(nèi)可見成肌纖維細(xì)胞增殖(圖2)。

2.4 TUNEL鑒定肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況

HH組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌凋亡指數(shù)(50.25%±6.18%)較N組降低(61.75%±6.17%,P<0.01)；ERS抑制劑4-PBA組凋亡指數(shù)(55.49%±6.46%)較N組降低(P<0.05)，較HH組升高(P<0.05)；ERS激動(dòng)劑TM組凋亡指數(shù)(38.77%±5.87%)較N組和HH組均顯著降低(P<0.01，圖3，見彩圖頁Ⅲ)。

2.5 各組大鼠肺組織GRP78、JNK、caspase-12、CHOP mRNA表達(dá)的比較

與N組相比，HH組、4-PBA組和TM組各ERS相關(guān)因子GRP78、JNK、caspase-12、CHOP mRNA的表達(dá)量均升高(P<0.05或P<0.01)。與HH組相比，4-PBA組JNK、caspase-12、CHOP mRNA的表達(dá)量輕微下調(diào)(P<0.05)，GRP78 mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)。與HH組相比，TM組JNK、caspase-12、CHOP mRNA的表達(dá)量輕微上調(diào)(P<0.05)，GRP78 mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01，表3，圖4)。

Fig.2Observation of lung tissue in each group by transmission electron microscopy(×5 000)

N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

The black arrows point to smooth muscle cells and the white arrows point to the endothelial cells

Fig.4The expression level of GRP78, JNK, caspase-12 and CHOP mRNA among the 4 groups

N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

2.6 各組大鼠肺組織GRP78、JNK、caspase-12、CHOP 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較

與N組相比，HH組、4-PBA組和TM組各ERS相關(guān)蛋白GRP78、JNK、caspase-12、CHOP蛋白質(zhì)表達(dá)量均升高，各差值均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HH組相比，4-PBA組GRP78、JNK、caspase-12、CHOP蛋白質(zhì)表達(dá)量均降低(P<0.05)；與HH組相比，TM組JNK、caspase-12蛋白質(zhì)表達(dá)量增加(P<0.05)，CHOP蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，GRP78蛋白質(zhì)的表達(dá)量無明顯變化(P>0.05，表4，圖5)。

3 討論

研究證實(shí)，ERS在PAH發(fā)病中起著重要作用。炎癥、病毒感染、缺氧、BMPRII的功能喪失、突變和由此導(dǎo)致的蛋白質(zhì)運(yùn)輸功能障礙等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致PAH[4-5]。Wu等[6]報(bào)道，野百合堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓伴隨著蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6，ATF6)、GRP78等ERS相關(guān)基因活化，表明在PAH發(fā)生過程中ERS被激活，提示肺動(dòng)脈重塑細(xì)胞增殖與凋亡失衡可能與ERS紊亂有關(guān)。建立慢性低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的方法已十分成熟，但臨床上PAH患者和/或PAH并發(fā)癥患者通常伴隨肺泡和血液中二氧化碳分壓升高，因此，吸入低氧伴高二氧化碳混合氣體制備肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型更符合臨床患者的發(fā)病情況。本實(shí)驗(yàn)采用5%～6% CO2和9%～11% O2的混合氣體造模，結(jié)果顯示大鼠在靜息狀態(tài)下肺動(dòng)脈平均壓、右心室肥大指數(shù)均不同程度升高，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，肺動(dòng)脈管壁增厚、管腔狹窄，表明低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型已復(fù)制成功。

Tab. 3 The comparison of the expression of GRP78, JNK, caspase-12 and CHOP mRNA among the 4 groups ±s, n=10)

N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

*P<0.05,**P<0.01vsN group；#P<0.05,##P<0.01vsHH group

Tab. 4 The comparison of the expression of GRP78, JNK, caspase-12 and CHOP protein among the 4 groups ±s, n=10)

N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

*P<0.05，**P<0.01vsN group；#P<0.05，##P<0.01vsHH group

Fig.5The expression level of GRP78, JNK, caspase-12 and CHOP protein among the 4 groups

N： Normoxic control group； HH： Hypoxia hypercapnia group； 4-PBA： ERS pathway inhibitor 4-phenylbutyric acid group； TM： ERS pathway agonist tunicamycin group

我們使用4-PBA作為抑制ERS的化學(xué)分子伴侶，目前尚不清楚4-PBA如何協(xié)調(diào)其保護(hù)作用及對(duì)參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路的影響，但是4-PBA減弱各組織中ERS的功效已被廣泛證實(shí)[7]。N-糖基化是跨膜糖蛋白成熟過程中的一個(gè)高度調(diào)控和關(guān)鍵步驟。TM是一種核苷類抗生素，抑制細(xì)胞中N-寡聚糖生物合成的第一步，導(dǎo)致糖蛋白不折疊，并引起錯(cuò)誤或未折疊的糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集，導(dǎo)致ER應(yīng)激誘導(dǎo)和細(xì)胞凋亡[8]。先前有報(bào)告顯示，破壞N-糖基化可以降低酪氨酸激酶受體和下游信號(hào)通路的蛋白質(zhì)水平[9]，提示用TM抑制N-糖基化是一種替代的機(jī)械方法以減少致癌信號(hào)和治療性抵抗。本實(shí)驗(yàn)采用TM作為ERS激動(dòng)劑，4-PBA作為ERS抑制劑，在模型大鼠上的用量以參考參考文獻(xiàn)[10-11]為主，預(yù)實(shí)驗(yàn)用量探索為輔，取得較好實(shí)驗(yàn)效果。

本研究應(yīng)用免疫熒光、電鏡和TUNEL等觀察低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓肺血管重塑情況，結(jié)合各組WA/TA值與LA/TA值、電鏡觀察結(jié)果及凋亡指數(shù)分析，提示低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓肺血管重塑可能與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖過度及凋亡過少有關(guān)，且ERS通路參與了肺血管重塑。本實(shí)驗(yàn)研究了ERS通路在低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓大鼠的調(diào)控作用，結(jié)果顯示在低氧高二氧化碳環(huán)境中ERS相關(guān)蛋白質(zhì)及mRNA(GRP78、JNK、caspase-12和CHOP)的表達(dá)都明顯升高(P<0.01)，應(yīng)用ERS抑制劑4-PBA后，這些蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)量都相應(yīng)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用ERS激動(dòng)劑TM后，JNK、CHOP、caspase-12蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平較HH組升高(P<0.05)，GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)水平與HH組無明顯差異。在多細(xì)胞真核生物中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由PERK、ATF6和肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)這三個(gè)上游信號(hào)蛋白感受，然后開始一連串的糾正行動(dòng)。這三條通路活動(dòng)共同構(gòu)成了未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(unfolded protein response，UPR)。在正常情況下，IRE1α與PERK及免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip)/GRP78復(fù)合體結(jié)合，處于無活性狀態(tài)；應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生時(shí)，未折疊蛋白和/或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，3種跨膜蛋白與Bip/GRP78分離而被激活。GRP78的急速上調(diào)標(biāo)志著ERS的開始，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶之一調(diào)節(jié)著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊、促進(jìn)細(xì)胞存活[12]。GRP78的上調(diào)可保護(hù)宿主細(xì)胞免受細(xì)胞外毒性因子所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而，研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或細(xì)胞毒性損傷引起的細(xì)胞GRP78表達(dá)上調(diào)是有限的[13]。這一點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果ERS激動(dòng)劑TM組GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)水平與HH組無明顯差異是一致的。長期低氧可以誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起GRP78表達(dá)上調(diào)，TM作為ERS激動(dòng)劑也可引起GRP78上調(diào)，因此低氧與TM雙重刺激可能加劇了ERS，其結(jié)果超出GRP78上調(diào)的上限，使得兩者差異不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，TM組大鼠CHOP的表達(dá)較HH組明顯增加(P<0.01)。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中最高可誘導(dǎo)基因之一，原因主要有：發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，解離的IRE1α產(chǎn)生bZIP轉(zhuǎn)錄因子，提高CHOP或GADD 153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK表達(dá)水平增加相應(yīng)地引起下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4和CHOP表達(dá)上調(diào)；ATF6的過表達(dá)直接導(dǎo)致下游CHOP的表達(dá)上調(diào)[14-16]。最終，過度UPR將導(dǎo)致CHOP的大量表達(dá)，而CHOP作為轉(zhuǎn)錄因子可抑制Bcl-2 (B-cell lymphoma-2)表達(dá)，削弱其抗凋亡能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。CHOP作為細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，一般情況下蛋白質(zhì)表達(dá)難以檢測，本實(shí)驗(yàn)利用延長牛奶封閉時(shí)間、增加一抗稀釋濃度及延長曝光時(shí)間等方法達(dá)到檢測目的。

綜上所述，低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重塑可能與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖過度及凋亡過少有關(guān)；ERS相關(guān)因子(JNK、caspase-12和CHOP)參與低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控。因此，我們?cè)O(shè)想抑制肺動(dòng)脈高壓中ERS相關(guān)因子的表達(dá)或許可作為治療肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)新的有效靶點(diǎn)。