當歸對實驗性血虛便秘模型小鼠結(jié)腸組織形態(tài)和黏液分泌的影響*

杜麗東， 任 遠△， 吳國泰， 牛亭惠， 王志旺， 邵 晶

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 730000； 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000)

血虛便秘是中醫(yī)臨床的一種常見證型，多見于老年，婦女產(chǎn)后、崩漏失血，或痔瘡、手術(shù)等大失血，以及憂思焦慮、用腦過度者。由于血虛津少或津液暗耗，不能下潤大腸，腸道干燥，故大便干結(jié)難下，癥見大便干結(jié)，頭暈目眩，心悸失眠，面色日光白無華，唇甲色淡，舌質(zhì)淡，脈細無力。中醫(yī)對其的治則是滋陰養(yǎng)血，潤腸通便[1]。

當歸是傘形科植物當歸Angelicaesinensis (Oliv.) Diels的干燥根，為甘肅道地藥材之一。具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效，主治血虛萎黃，眩暈心悸，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，虛寒腹痛，腸燥便秘，風濕痹痛，跌打損傷，癰疽瘡瘍等。古典醫(yī)籍《沈氏尊生書》記載的“潤腸丸”和《脾胃論》記載的“導滯通幽湯”均以當歸配伍治療血虛便秘；當代名中醫(yī)亦喜用當歸配伍治療血虛便秘，如李國棟自擬“養(yǎng)血潤腸方”[2]，張東岳之“秘寶康”[3]等。用當歸的補血潤腸功效，治療血虛便秘取得了良好的療效。

本研究采用灌胃復方地芬諾酯聯(lián)合皮下注射乙酰苯肼并腹腔注射環(huán)磷酰胺復制小鼠血虛便秘模型，灌胃當歸水煎液進行干預，通過觀察小鼠一般狀態(tài)，檢測首粒黑便排出時間(FBDT)、糞便和結(jié)腸含水量，取結(jié)腸組織進行HE和AB-PAS染色，觀察小鼠結(jié)腸組織形態(tài)變化和黏液分泌情況，初步探討當歸防治血虛便秘的作用及機制，為擴大當歸防治血虛便秘的臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

當歸飲片，批號：160502，蘭州復興厚藥材有限公司生產(chǎn)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院劉峰林副教授鑒定，為傘形科植物當歸Angelicaesinensis(Oliv.) Diels根的切片。當歸水煎液的制備方法為：取當歸飲片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，濾過，藥渣加6倍量水煎煮1 h，合并兩次濾液，過濾，濃縮至1.7 g生藥/ml，置冰箱冷藏，用時平衡至室溫。復方地芬諾酯片(compound diphenoxylatetablet，DPN)，批號：1605030，常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；乙酰苯肼(N-acetylphenylhydrazine，APH)，批號：20150701258，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CPA)，批號：04150405，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；常通舒顆粒，批號：160101，貴州威門藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)?；钚蕴?，批號：20150903，煙臺市雙雙化工有限公司生產(chǎn)；阿拉伯樹膠粉，批號：20150128，上海中秦化學試劑有限公司生產(chǎn)；過碘酸-雪夫染色(Alcian blue-periodic acid Schiff staining, AB-PAS)試劑盒，批號：20150928，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要儀器

BX51-32H01型顯微鏡(日本Olympus)。BS110型電子天平(德國 Sartorius)。TEC5型組織包埋機，VIP5全自動密閉式組織脫水機(日本Sakura Finetek公司)。RM2135石蠟切片機(德國Leica公司)。電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2) g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK (甘) 2015-0002。小鼠自由攝食、飲水，喂食標準飼料(由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)，飼養(yǎng)溫度(20～24) ℃，相對濕度50%～60%。

1.4 分組、造模及給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，按性別、體重隨機分為6組：正常對照組(Control)、血虛便秘模型組(Model)、陽性對照組(Positive)、當歸高劑量組(HDD)、當歸中劑量組(MDD)、當歸低劑量組(LDD)，n=10。參考文獻并在預實驗的基礎(chǔ)上[4-5]，除正常組外，其余各組小鼠灌胃DPN混懸液25 mg/kg，1次/d，5 d為一個給藥周期，共4個周期，每兩個周期間停藥2 d；并在實驗的第1、4、7、10天皮下注射APH 60mg/kg，實驗第10～14天腹腔注射CPA 40mg/kg，復制小鼠血虛便秘模型。從實驗第14天起，當歸高、中、低劑量組小鼠分別灌胃當歸水煎液16.67、8.33、4.17g生藥/kg (分別相當于臨床上60kg體重成人日用藥量的20、10和5倍)；陽性對照組小鼠灌胃常通舒顆粒溶液5 g/kg(相當于臨床上60 kg體重成人日用藥量的5倍)；正常對照組和血虛便秘組小鼠灌胃等體積生理鹽水。造模藥物DPN混懸液每天上午9:00給藥，治療藥物當歸水煎液、通舒顆粒溶液及生理鹽水每天下午16:00給藥；給藥容積10 ml/kg，連續(xù)28 d。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般狀態(tài) 實驗期間觀察各組小鼠活動狀態(tài)，毛色，口、鼻、唇、尾顏色，糞便性狀和數(shù)量。

1.5.2 首粒黑便排出時間、糞便含水量和結(jié)腸含水量 實驗第27天，各組小鼠 (已禁食不禁水12 h) 灌胃5%活性炭末糊0.5 ml/只，單籠飼養(yǎng)并記錄每只小鼠首粒黑便排出時間。實驗第28天，取血后處死小鼠，取結(jié)腸殘留糞便，稱濕重，80℃恒溫干燥10 h，稱干重，按下式計算糞便含水量，糞便含水量=(濕重-干重)/濕重×100%；在距盲腸2 cm處取結(jié)腸長約2 cm，稱濕重，60℃恒溫干燥6 h，稱干重，按下式計算結(jié)腸含水量，結(jié)腸含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.3 結(jié)腸組織形態(tài)學觀察 實驗第28天，各組小鼠在距直腸2 cm處取結(jié)腸長約1 cm，縱行剖開，用冷生理鹽水沖洗干凈，縱向取結(jié)腸肌條，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，100倍光鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學變化。

1.5.4 結(jié)腸黏液分泌 實驗第28天，各組小鼠在距直腸3 cm處取結(jié)腸長約1 cm，使用carnoy固定液(無水乙醇：冰醋酸：氯仿=6:1:3，V/V/V)固定，石蠟包埋切片，AB-PAS染色，200倍光鏡下觀察結(jié)腸黏液分泌[6]。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 對小鼠一般狀態(tài)的影響

正常對照組小鼠反應靈敏，被毛密而有光澤，糞便形狀規(guī)則，質(zhì)稍軟，互不粘連。與正常對照組比較，血虛便秘組小鼠蜷縮，萎靡，被毛枯疏、易掉、光澤暗淡，耳、鼻、唇、尾膚色蒼白，排便數(shù)量減少，糞便干結(jié)、粘連。與血虛便秘組小鼠比較，陽性對照組、當歸高、中、低劑量組小鼠上述血虛和便秘癥狀，有不同程度改善。

2.2 對小鼠排便、糞便和結(jié)腸含水量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠首粒黑便排出時間(first black defecation time, FBDT)明顯延后，糞便含水量(water content in stool, WCIS)和結(jié)腸含水量(water content in colon,WCIC)均明顯降低(P<0.01)。與血虛便秘組小鼠比較，陽性對照組、高、中、低3個劑量當歸組小鼠FBDT明顯延后(P<0.01，P<0.05，表1)，WCIC明顯增加(P<0.01，P<0.05)，陽性對照組、當歸高、中劑量組小鼠WCIS明顯增加(P<0.05，表1)。

2.3 對小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學變化的影響

正常小鼠結(jié)腸黏膜層(包括上皮層、固有層、黏膜肌層)、黏膜下層、肌層和漿膜層均未見明顯病理改變，結(jié)腸黏膜層較厚，黏膜上皮完整，排列整齊，黏膜固有層大腸腺飽滿。模型組小鼠結(jié)腸黏膜層萎縮變薄，黏膜固有層大腸腺明顯萎縮，黏膜下層、肌層和漿膜層未見異常病理改變(圖1)。

GroupFBDT(min)WCIS(%)WCIC(%)Control140.5±24.670.7±3.376.4±6.1Model199.8±33.0**47.9±11.9**58.8±7.4**Positive160.9±25.0##58.4±7.9#68.8±8.0#HDD154.6±34.7##60.9±8.9#70.9±8.7##MDD157.0±38.5#57.4±9.0#68.9±10.1#LDD162.1±36.2#56.7±9.869.1±9.4#

FBDT： First black defecation time； WCIS： Water contentinstool； WCIC： Water contentincolon； HDD： High-doseDanggui group； MDD： Middle-dose Danggui group； LDD： Low-doseDanggui group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig.1The comparison of histomorphology of colon in mice between the 6 groups(HE staining ×10)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positivecontrolgroup; D: High-doseDangguigroup; E: Middle-doseDanggui group; F: Low-doseDanggui group

與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜層厚度明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，當歸高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜層厚度均明顯增加(P<0.05，表2)。當歸高、中、低劑量組結(jié)腸黏膜層厚度之間無統(tǒng)計學差異。

GroupDose(crude drug g/kg)MT (μm)Control —537.8±89.0Model —437.2±95.4**Positive 5507.7±84.7#HDD16.67509.4±82.8#MDD8.33503.3±89.4#LDD4.17503.1±87.5#

MT: Mucosa thickness； HDD: High-doseDanggui group； MDD: Middle-dose Danggui group； LDD: Low-doseDanggui group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 對小鼠結(jié)腸黏液分泌的影響

正常小鼠結(jié)腸黏膜層上皮細胞和杯狀細胞形態(tài)飽滿、圓潤，黏液分泌豐富，黏膜表面覆蓋混合性黏液；模型組小鼠黏膜層上皮細胞和杯狀細胞出現(xiàn)不同程度萎縮，黏膜表面黏液覆蓋減少。當歸高、中、低劑量組小鼠黏膜層上皮細胞和杯狀細胞的萎縮有不同程度的恢復，黏液分泌增多(圖2)。

Fig.2The comparison of colon mucus secretion in mice among the 6 groups(AB-PAS staining ×20)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positivecontrolgroup; D: High-doseDangguigroup; E: Middle-doseDanggui group; F: Low-doseDanggui group

3 討論

中醫(yī)理論認為，血虛是因失血過多、脾胃虛弱、血液生化之源不足或者瘀血阻滯導致的血液不足，和(或)血的濡養(yǎng)功能減退引起的一種病理狀態(tài)[7]。因血液虧損，臟腑百脈失養(yǎng)，最終導致全身虛弱，患者常表現(xiàn)為面色蒼白，唇、舌、指甲色淡無華，頭暈，心悸失眠，手腳發(fā)麻或脈細弱等?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，貧血的形成原因包括紅細胞生成減少(骨髓造血功能障礙、造血物質(zhì)缺乏或利用障礙)，紅細胞丟失或破壞過多(失血、溶血)等[2]。在中醫(yī)實驗研究中，常借鑒貧血的研究方法來研究和認識血虛證。現(xiàn)代研究建立的血虛模型包括失血性血虛模型、乙酰苯肼(APH)溶血性血虛模型、環(huán)磷酰胺(CPA)化學損傷性血虛模型和60Co-γ輻射損傷血虛模型[8-11]。本研究利用APH緩慢氧化破壞紅細胞膜，使紅細胞崩解、溶血、數(shù)量減少；利用CPA引起骨髓抑制，使造血細胞生成減少、白細胞和粒細胞數(shù)量減少，從雙重環(huán)節(jié)造成實驗小鼠出現(xiàn)血虛癥。利用復方地芬諾酯 (DPN) 作用于腸壁阿片受體，降低腸道敏感性，提高平滑肌張力，提高回盲瓣和肛門括約肌張力，使腸蠕動減弱，腸內(nèi)容物滯留時間延長、水分重吸收增多，產(chǎn)生收斂止瀉作用。采用該復合方法建立的血虛便秘模型小鼠出現(xiàn)蜷縮萎靡、體毛枯疏、光澤暗淡，耳、鼻、唇、尾膚色蒼白，糞便干結(jié)、排便時間延長、結(jié)腸和糞便含水量降低等表現(xiàn)，基本能體現(xiàn)中醫(yī)血虛便秘證候[4-5,12-15]。

高、中、低三個劑量(16.67、8.33和4.17 g/kg·d) 的當歸水煎液均能使首粒黑便排出時間提前，增加結(jié)腸含水量；16.67、8.33 g/kg·d的當歸水煎液可使血虛便秘模型小鼠糞便含水量升高，以上結(jié)果為從結(jié)腸糞便水分吸收角度闡釋當歸“潤腸通便”傳統(tǒng)功效的藥理機制提供了實驗數(shù)據(jù)。常通舒顆粒由何首烏、當歸、赤芍、火麻仁、桑椹五味藥材組成，具有滋陰養(yǎng)血，潤腸通便功效，用于習慣性便秘、老年性便秘及產(chǎn)后便秘，在研究中常用作血虛腸燥便秘的陽性對照藥物[3]。

結(jié)腸腸壁由內(nèi)向外依次為黏膜層 (包括上皮層、固有層、黏膜肌層)、黏膜下層、肌層和漿膜層。黏膜層的杯狀細胞能合成、貯存黏液并將其分泌至腸腔，起潤滑和保護腸壁的作用。研究顯示，便秘時結(jié)腸黏膜腺體萎縮，腺泡減少且分布稀疏[16]。杯狀細胞分泌的黏液中所含的以氨基乙糖和游離的乙糖基為代表的中性黏多糖，在過碘酸-雪夫染色(periodic acid Schiff staining, PAS)時呈紅色；以分子末端含有唾液酸和硫酸酯類為代表的酸性黏多糖，在阿利新藍染色 (Alcian blue staining, AB) 時呈藍綠色；混合性黏液呈紫色[6]。本研究顯示，灌胃16.67、8.33和4.17 g/kg·d三個劑量的當歸水煎液干預后，模型組小鼠結(jié)腸黏膜和大腸腺體的萎縮出現(xiàn)不同程度的改善，黏膜層厚度明顯增加，黏液分泌增加，以上結(jié)果為從結(jié)腸黏液分泌角度闡釋當歸“潤腸通便”傳統(tǒng)功效的藥理機制提供了實驗數(shù)據(jù)。

綜上所述，當歸可改善血虛便秘模型小鼠的血虛便秘證候、增加結(jié)腸和糞便含水量、軟化糞便、促進糞便的排出，改善小鼠結(jié)腸黏膜和大腸腺體的萎縮，增加粘膜層厚度并增加黏液分泌，發(fā)揮其“潤腸通便”的功效。