犬源芽孢桿菌分離鑒定及其耐受性的研究

冀婉玥　林康　孟林　魏志波　溫建新

摘 要：芽孢桿菌作為益生菌的一種，具備維持動物腸道菌群平衡、增強動物機體免疫力、提高動物生產(chǎn)性能等功能。本試驗應用肉湯瓊脂從正常比格犬的糞便中分離純化出菌株，進行了染色鏡檢、生化試驗、PCR測序及耐受性試驗。結(jié)果表明：革蘭氏染色陽性，鏡檢芽孢顯著，生化試驗及PCR測序的結(jié)果表明此菌株為芽孢桿菌；耐熱性試驗結(jié)果表明，在80 ℃條件下芽孢桿菌仍可以生長，有很高的熱穩(wěn)定性；耐酸試驗結(jié)果表明其對酸的耐性較強，適宜的pH值應在3～5之間；在模擬胃液和腸液中，芽孢桿菌在1.5 h后的存活率均為80%左右。綜合而言，分離的犬源芽孢桿菌具備耐胃液、耐高溫、耐膽鹽等理化特征，該試驗結(jié)果為犬源微生態(tài)制劑的研制奠定了基礎。

關(guān)鍵詞：比格犬；芽孢桿菌；分離鑒定；生物學特性

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.001

Abstract：Bacillus was a kind of probiotics， and has the functions of maintaining the balance of intestinal flora of animals， enhancing the immunity of animals， and improving animal production performance. In this experiment， broth agar was used to separate and purified the strains from the feces of normal beagle dogs， and staining microscopy， biochemical tests， PCR sequencing， and tolerance tests were performed. The identification results showed that Gram stain was positive， spore staining microscopic examination was clear， biochemical tests and PCR sequencing results proved that this strain was Bacillus. The heat resistance test results showed that Bacillus could grow at 80 °C and had high thermal stability. Acid resistance test results showed that it was suitable for acid resistance， and the suitable pH should be between 3 and 5. In simulated gastric fluid and intestinal fluid， the viability of Bacillus was approximately 80% after 1.5 h. The Bacillus separate from the experiment had resistance to gastric juice， high temperature， and bile salts， providing the foundation for the development of canine-derived microecological preparations.

Key words： Beagle dog； Bacillus； isolation and identification； biological characteristics

益生菌是一類與抗生素相對的有利于動物健康的活性微生物，大多匯集在人或動物的胃腸道等消化系統(tǒng)中，有助于維持動物胃腸道微生態(tài)的均衡[1]。益生菌制劑也稱為微生態(tài)制劑，如今，我國頒布的《飼料添加劑品種目錄（2006）》允許使用的益生菌包含16種。在眾多的益生菌中，酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等都是符合條件的益生菌制劑和飼料添加劑，芽孢桿菌更是其中應用相對普遍的菌種之一[2]。此外，大多酵母菌也屬于益生菌[3-4]。溫度在37 ℃左右時，芽孢桿菌可以正常生長增殖，在 80 ℃的溫度下也能夠生存，具備優(yōu)良的耐熱、耐強酸及耐膽鹽能力；對環(huán)境有很適應能力，在惡劣的環(huán)境下，芽孢桿菌能夠在細胞內(nèi)形成一個圓形或橢圓形的休眠體結(jié)構(gòu)，即芽孢，能很好的生存下去。芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，本身沒有致病因素，只有一層細胞外膜，能夠分泌蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、纖維素酶等，可提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用能力[5]。以前的研究結(jié)果大多把芽孢桿菌作為過路菌[6]，近幾年來一些最新的報告及研究結(jié)果指出有些芽孢桿菌可以黏附定殖。經(jīng)試驗研究顯示，芽孢桿菌可以明顯地減少產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的數(shù)量，其中原因是芽孢桿菌在產(chǎn)生芽孢的同時能夠產(chǎn)生多種抗生素，如枯草菌素A、制霉菌素、多粘菌素、短桿菌肽等，芽孢桿菌對腸致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌及宋內(nèi)志賀菌的拮抗作用最為顯著。除此之外，芽孢桿菌還能夠分泌維生素、氨基酸、促生長因子等多種營養(yǎng)成分，促進動物機體吸收，參與動物機體物質(zhì)循環(huán)，加快動物機體新陳代謝[5]。

芽孢桿菌是國家農(nóng)業(yè)部公開聲明的容許可以直接飼喂動物的益生菌菌種之一，芽孢桿菌類益生菌添加劑是選取正常微生態(tài)中或自然中的無害芽孢桿菌，經(jīng)過科學方法分離[7]、鑒別[8]、增殖、干燥[9]等眾多工序制作的一類新型活菌制劑[10-12]。在一定的環(huán)境下，芽孢桿菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)經(jīng)過一系列的變化，最終變成一個完整的芽孢，對熱、酸、胃液和腸液等有較高的抗性。芽孢桿菌以芽孢的狀態(tài)進入動物的腸道中，具備疾病預防，促進動物生長等功效，且沒有毒性，無殘留，能夠萌發(fā)為具有新陳代謝功能的營養(yǎng)體并發(fā)揮益生作用。

本試驗從健康的比格犬糞便中進行有益菌的篩選分離純化，經(jīng)生化鑒定及PCR測序從所得菌中挑選出芽孢桿菌，對其生物學特性進行了一系列的試驗，以期為其應用于犬的飼料添加劑和益生菌制劑的研制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑與儀器 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染色液、5%的孔雀綠染液、0.5%的沙黃染液、生理鹽水、糖醇發(fā)酵管、紫外分光光度計（上海一恒科學儀器有限公司）、電子天平（上海一恒科學儀器有限公司）、高壓滅菌鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、顯微鏡（上海一恒科學儀器有限公司）、冰箱、錐形瓶、離心管、酒精燈、水浴鍋、平板、超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）、溫箱（深圳天南海北有限公司）、恒溫震蕩器（深圳天南海北有限公司）、凝膠成像儀注射器（深圳天南海北有限公司）、微量移液器、槍頭。

1.2 方 法

1.2.1 細菌的分離純化 選取腸糞便樣品1 g，放入含生理鹽水9 mL的離心管中，振蕩混勻30 min，使其成為均勻的懸濁液，放置20 min，制成10-1的稀釋液。

取200 μL樣品的稀釋液均勻涂布在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取單菌落在載玻片上革蘭氏染色后鏡檢。將疑似陽性的菌落接種到肉湯瓊脂培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，記為“25號菌”。

1.2.2 染色鏡檢 （1）革蘭氏染色。挑取單菌落，在載玻片上進行抹片，等其自然干燥固定后，用結(jié)晶紫染液第一次染色2 min，水洗0.5 min；用碘-碘化鉀溶液浸染2 min，水洗0.5 min；滴加95%酒精浸透30 s，進行脫色，水洗0.5 min；最后用紅色的沙黃染液進行第二次染色，水洗，吸干，鏡檢。

（2）芽孢染色。挑取單菌落，在載玻片上進行抹片，待其經(jīng)火焰固定后，滴加5%孔雀綠水溶液于其上，加熱30～60 s，重復3～4次，水洗0.5 min；用0.5%沙黃水溶液復染0.5 min，用水沖洗，自然干燥后鏡檢。

1.2.3 生化鑒定 根據(jù)常用試驗方法對分離菌進行糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗、葡萄糖的氧化/發(fā)酵試驗、甲基紅（MR）試驗、維培二氏試驗（VP試驗）、淀粉水解試驗、吲哚（靛基質(zhì)）試驗、尿素酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、過氧化氫酶（觸酶）試驗、硝酸鹽還原試驗等生理生化試驗，在37 ℃溫度條件下恒溫培養(yǎng)24 h后對結(jié)果進行觀察。

1.2.4 PCR鑒定 在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中將分離的菌株接種培養(yǎng)增殖，取1 mL菌液10 000 r·min-1離心2 min，棄去上層清液，加入20 μL生理鹽水混勻，制作菌液模版。

使用芽孢桿菌屬通用引物：正向引物Primer A：5'～AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG～3'，反向引物Primer B：5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'[13]。

PCR反應體系：Premixed Taq 25 μL，正反向引物各加1 μL，DNA模板2 μL，補ddH2O至體積為50 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，循環(huán)30 次；72 ℃ 5 min延伸。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1 EB）電泳后在AlphaView S A凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.2.5 生長曲線及產(chǎn)酸試驗 把分離純化出來的25號菌接種于盛有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（接種量為1∶50）的三角瓶中，在37 ℃下，選擇200 r·min-1搖菌培養(yǎng)24 h。其中每隔2 h 取菌液在紫外分光光度計中檢測菌液的OD600值和pH值，記錄并制作生長曲線。

1.2.6 耐熱試驗 查閱資料，芽孢桿菌為耐高溫菌，選擇80 ℃下以時間為變量進行試驗。

用移液器取200 μL搖好的菌液加入到高壓滅菌好的1.5 mL的離心管中，總共裝3只。分別記為“25號菌80 ℃ 2 min”、“25號菌80 ℃ 5 min”、“25號菌80 ℃ 10 min”。

將分裝好的3只離心管按標記分別放入80 ℃的恒溫水浴鍋2，5，10 min。進行倍比稀釋，取稀釋倍數(shù)為105，106，107三個梯度菌液各200 μL，均勻點滴在平皿中，待配好的培養(yǎng)基冷卻至不燙手，傾注平板，每個平板10～15 mL，每個梯度做兩個平行試驗。培養(yǎng)一段時間后，進行菌落計數(shù)。

1.2.7 耐酸試驗 用37%的HCl溶液將液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至1.5，3.0，5.0，高壓滅菌，備用。

取900 μL的pH值 1.5的培養(yǎng)基，加入搖好的菌液100 μL，混勻。放入37 ℃恒溫水浴鍋中，每30 min取出倍比稀釋，取稀釋倍數(shù)為103，104，105三個梯度菌液各200 μL，均勻點滴在平皿中，待配好的培養(yǎng)基冷卻至不燙手，傾注平板，每個平板10～15 mL，每個梯度做兩個平行實驗。

pH=3和pH=5如上述操作依次進行。培養(yǎng)一段時間后，進行菌落計數(shù)。

1.2.8 耐胃液試驗 配置液體培養(yǎng)基，用37%的HCl溶液將液體培養(yǎng)基調(diào)至pH=3.0，高壓滅菌，備用。

按5 mg·mL-1的量在上述培養(yǎng)基中加入胃蛋白酶，待其徹底溶解后混勻。用0.22 mm的濾器將所得培養(yǎng)基過濾除菌，放入高壓滅菌好的三角瓶里。按10%量接種25號菌于上述三角瓶的液體內(nèi)，混勻。從三角瓶中取3.5 mL液體裝到高壓滅菌的4 mL離心管中，記為“25號菌0 min”，測其OD600。將剩余三角瓶中液體置于37 ℃搖床中培養(yǎng)，每隔30 min取出3.5 mL液體，記為“25號菌Xmin”，測其OD600。

1.2.9 耐腸液試驗 配置液體培養(yǎng)基，高壓滅菌，備用。在配置好的液體培養(yǎng)基中按千分之三的量加入膽鹽，按10 mg·mL-1的量加入胰蛋白酶，完全溶解后混勻。

用0.22 mm的濾器將培養(yǎng)基過濾除菌，置于高壓滅菌好的小三角錐形瓶中。在超凈工作臺中取出3.5 mL上述液體于高壓滅菌的4 mL離心管中，記為“25號菌調(diào)零液”，按10%的量接種25號菌于上述三角錐形瓶的液體中，混勻。從三角瓶中取出3.5 mL液體裝到高壓滅菌好的4 mL離心管中，記為“25號菌0 min”，測其OD600。將剩余三角瓶中液體置于37 ℃搖床中培養(yǎng)，每隔30 min取出3.5 mL液體，記為“25號菌Xmin”，測其OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及染色鏡檢結(jié)果

把從糞便中分離純化的菌命名為25號菌。菌落（圖1-A）為干燥型，顏色為白灰色、沒有光澤，表面不光滑，菌落為米粒大?。桓锾m氏染色（圖1-B）表現(xiàn)陽性，鏡檢芽孢顯著，菌體呈橢圓形；芽孢染色鏡檢（圖1-C），在視野中觀察到清晰的紅色菌體，芽孢呈綠色，邊緣不整齊。

2.2 生化試驗結(jié)果

25號菌的生理生化試驗結(jié)果見表1。依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9-10]的參考標準，試驗結(jié)果符合芽孢桿菌的各種特性，初步判斷分離菌株為芽孢桿菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

25號菌用芽孢桿菌屬的引物PCR鑒定，電泳結(jié)果（圖2）顯示，在1 600 bp處有特異性條帶，跟預期相符，確定25號菌為芽孢桿菌。

2.4 生長曲線及產(chǎn)酸試驗結(jié)果

從圖3可以看出，前8 h菌株快速繁殖，25號菌此時處于對數(shù)期，OD600值處于持續(xù)增長的狀態(tài)，同時pH值開始逐漸升高；8 h后，菌株OD600值和pH值處于穩(wěn)定期，分別穩(wěn)定在2.452和8.31。

2.5 耐熱試驗結(jié)果

由表2可知，在80 ℃下，隨著時間的增長，菌的數(shù)量正常增長。

2.6 耐酸試驗結(jié)果

從圖4可以看出在pH值為1.5和3時，25號菌的數(shù)量較小，說明pH值為3和1.5不適合菌的生長；pH值為5時，25號菌生長情況良好。

2.7 耐胃液試驗結(jié)果

從圖5可以看出，2.5 h內(nèi)，25號菌在模擬胃液中測的OD值平均在1.5左右，且隨時間的增長，菌的數(shù)量有所下降；在2.5 h時，測得的OD值為1，表明25號菌仍可正常的生長。

2.8 耐腸液試驗結(jié)果

從圖6可以看出，25號菌在模擬腸液中的存活率隨著時間的增長逐漸降低，但仍有很高的數(shù)量級；在1.5 h存活率保持在80%左右，2.5 h試驗結(jié)束時存活率仍高達60%以上。

3 討 論

本次試驗對從正常犬糞便中分離純化得到的菌株進行了菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色、芽孢染色及生理生化試驗，鑒定結(jié)果與從健康肉雞糞便中分離得到的芽孢桿菌的形態(tài)特征、理化試驗的結(jié)果相同[11]，經(jīng)PCR鑒定確定為芽孢桿菌。菌株在前8 h處于對數(shù)期，菌株快速繁殖，8 h后處于穩(wěn)定期。查閱文獻[12]，芽孢桿菌為耐熱菌，本次試驗在80 ℃下對分離菌株進行不同時長的培養(yǎng)，倒板計數(shù)后利用SPSS統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表現(xiàn)沒有差異，在高溫條件下，菌株能夠正常生長增殖，菌株具有良好的熱穩(wěn)定性。耐酸試驗中，在強酸環(huán)境下，菌株可以正常生長增殖，耐酸性好，適宜的pH值范圍為3～5。 芽孢桿菌除了維持動物胃腸道內(nèi)的菌群穩(wěn)定外，還有其他的有益作用尚待發(fā)掘，其作用機理仍然需要進一步研究。

參考文獻

[1]李劃. 動物營養(yǎng)與飼料中芽孢桿菌的應用分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016（12）：219.

[2]邱雪興，駱宏機，劉文聰. 芽孢桿菌在動物營養(yǎng)與飼料中的應用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014（5）：194-195，164.

[3]李軍訓，羅學剛，高潔，等. 益生菌的分類、生理功能與有效性評價研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2010（6）：49-55.

[4]施安輝. 益生菌制劑的主要類群、作用機理及應用[J]. 山東食品發(fā)酵，2009（3）：9-13.

[5]李春鳳，林顯華，谷巍. 枯草芽孢桿菌在飼料生產(chǎn)及環(huán)境防治中的應用[J]. 中國飼料，2013（1）：10-12，17.

[6]王振華，潘康成. 不同濃度中藥對枯草芽孢桿菌體外生長的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2007（10）：44-45.

[7]趙士豪，楊會琴，趙春海. 益生菌芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J]. 中國農(nóng)學通報，2012（18）：271-275.

[8]魏亞松，鄒玲，溫建新，等. 水貂腸道枯草芽孢桿菌的分離及16S rRNA鑒定[J]. 中國動物檢疫，2013（6）：36-39.

[9]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：43-65.

[10]胡桂學.獸醫(yī)微生物學實驗教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2006.

[11]張紅英，楊霞，金鉞，等.雞腸源芽胞桿菌的分離、鑒定和抗菌活性[J].中國微生態(tài)學雜志，2007，19（6）：504-506.

[12]張璐.飼用芽孢桿菌產(chǎn)品益生特性的體外評價研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2008.