多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)化芪蛭益肺顆粒水提醇沉工藝

王文平 倪健 冷新

摘要：目的 采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選芪蛭益肺顆粒的最佳提取及醇沉工藝。方法 以黃芪中黃芪甲苷、葶藶子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的提取率及干膏得率為指標(biāo)，優(yōu)選芪蛭益肺顆粒的提取工藝；以黃芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的保留率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳醇沉工藝。結(jié)果 最佳水提工藝為：加10倍量水，提取1.5 h，共提取3次。最佳醇沉工藝為：濃縮至相對(duì)密度1.05～1.10（60 ℃），加乙醇至60%醇沉。結(jié)論 本試驗(yàn)優(yōu)選的水提醇沉工藝穩(wěn)定可行，可為該制劑生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芪蛭益肺顆粒；水提醇沉；黃芪甲苷；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.017

中圖分類號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0071-05

Abstract： Objective To optimize the extraction and alcohol precipitation process of Qizhi Yifei Granules by multi index orthogonal experiment. Methods With extraction rate of astragaloside in Astragali Radix， quercetin-3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside in Descurainiae Semen Lepidii Semen and yield rate of dry extract as indexes， the extraction process of Qizhi Yifei Granules was optimized. Taking the retention rate of astragaloside and quercetin-3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside as indexes， the alcohol precipitation process was optimized. Results The best water extraction process was as follows： adding 10 times amount of water， extracting for 1.5 h， 3 times. The optimum alcohol precipitation process was： concentrated to the relative density of 1.05–1.10 （60 ℃）， adding ethanol to 60% and alcohol precipitation. Conclusion The optimized extraction and alcohol precipitation process is stable and feasible， which can provide the basis for the preparation.

Keywords： Qizhi Yifei Granules； water extraction and alcohol precipitation； astragaloside； quercetin-3-O-β-D- glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside

芪蛭益肺顆粒為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院治療慢性阻塞性肺疾病的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、制水蛭、酒黃精、清半夏、浙貝母等10味藥組成，具有補(bǔ)氣潤(rùn)肺、消腫散結(jié)、化痰止咳平喘功效，經(jīng)臨床應(yīng)用多年，療效顯著。本方重用黃芪補(bǔ)氣升陽、行滯通痹，酒黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺，葶藶子瀉肺平喘、利水消腫。原方為湯劑，由于顆粒劑具有性質(zhì)穩(wěn)定、生物利用度高、便于工業(yè)化生產(chǎn)和攜帶、服用方便的優(yōu)點(diǎn)，遂將其開發(fā)成顆粒劑。結(jié)合文獻(xiàn)研究[1-10]，確定制劑工藝為：3味藥提取揮發(fā)油，其余7味藥水提，2份濾液合并后醇沉。

本研究以黃芪中黃芪甲苷和葶藶子中槲皮素-3- O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷及出膏率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化芪蛭益肺顆粒處方提取工藝及醇沉工藝，確定芪蛭益肺顆粒在生產(chǎn)中的工藝參數(shù)，為制劑生產(chǎn)提供支撐性數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），安捷倫1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（奧泰公司），HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），KQ5200DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），ZDHM型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），BT125D型電子分析天平（賽多利斯，0.01 mg），JY5002電子天平（上海衡平儀器儀表廠，0.1 mg）。

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-201515）、槲皮素- 3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品（批號(hào)111854-201203），中國食品藥品檢定研究院；黃芪（批號(hào)20160621，北京本草芳源藥業(yè)有限公司）、制水蛭[批號(hào)601102409，北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司]、酒黃精（批號(hào)20160518，北京本草芳源藥業(yè)有限公司）、清半夏（批號(hào)20160328，北京本草芳源藥業(yè)有限公司）、浙貝母（批號(hào)20160512，北京本草芳源藥業(yè)有限公司）、葶藶子（批號(hào)20160325，北京本草芳源藥業(yè)有限公司）、前胡（批號(hào)20160510，北京本草芳源藥業(yè)有限公司），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司），水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（30∶70）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）參數(shù)：漂移管溫度100 ℃，載氣（壓縮空氣）流速2.7 L/min，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。黃芪甲苷峰的保留時(shí)間為16.275 min，分離度>1.5，表明此方法可行。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.502 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

按處方稱取飲片9份，各64 g，按L9（34）正交試驗(yàn)安排進(jìn)行提取，濾液過濾，濃縮定容至1000 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻后用250 mL容量瓶精密量取250 mL藥液，離心除去不溶于水的雜質(zhì)，將離心后的上清液濃縮至25 mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，萃取液用氨試液萃取2次，每次50 mL，棄去氨試液，蒸干，用甲醇復(fù)溶，定容至5 mL容量瓶中，測(cè)定黃芪甲苷含量[11]。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱取除黃芪外的其他藥物飲片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%醋酸溶液（11∶89）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量25 μL。色譜圖見圖2。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷峰的保留時(shí)間為5.6 min，分離度>2.5，表明此方法可行。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對(duì)照品適量，加30%甲醇制成濃度為0.020 1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

按處方稱取飲片9份，各64 g，按L9（34）正交試驗(yàn)安排進(jìn)行提取，濾液過濾，濃縮定容至1000 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻后取1 mL，過微孔濾膜，取續(xù)濾液，測(cè)定提取液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的提取率。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例稱取除葶藶子外的其他藥物飲片，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 水提工藝優(yōu)選

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過查閱文獻(xiàn)及對(duì)本研究目的的考慮[12-14]，選擇加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)三因素，考察加水8、10、12倍量，提取1、1.5、2 h，提取1、2、3次對(duì)提取結(jié)果影響，采用L9（34）正交表，以黃芪甲苷提取率、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷提取率、干膏得率為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提工藝，因素水平見表1。

2.3.2 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

按處方稱取飲片9份，各64 g，按正交試驗(yàn)安排進(jìn)行提取，取正交試驗(yàn)的9份供試品溶液，分別定容至1000 mL容量瓶中，按“2.1.3”“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷提取率。另取正交試驗(yàn)的9份供試品溶液，各精密量取250 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，計(jì)算干膏得率。結(jié)果見表2，方差分析見表3～表5。

考慮到加權(quán)平均法對(duì)于各因素判定的主觀性[15-16]，本研究采用綜合分析各因素優(yōu)選最佳工藝的方法。綜合方差分析結(jié)果顯示，C因素（提取次數(shù)）對(duì)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的提取率及干膏得率有顯著影響（P<0.05），且通過比較2個(gè)指標(biāo)的K值發(fā)現(xiàn)，兩因素均K3>K2>K1，故提取次數(shù)確定為3次；A因素和B因素對(duì)3個(gè)指標(biāo)均無顯著影響，通過K值比較，對(duì)于黃芪甲苷提取率為A3B2C3，對(duì)于槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷提取率為A2B2C3，對(duì)于干膏得率為A3B3C3，綜合考慮生產(chǎn)中的時(shí)間成本、資金成本，以及各指標(biāo)K值，最終確定提取工藝為A2B2C3，即加10倍量水，提取1.5 h，提取3次。

2.3.5 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步考察最佳工藝的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，按已確定的最優(yōu)工藝進(jìn)行3批平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6，表明正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝方案準(zhǔn)確、穩(wěn)定可行。

2.4 醇沉工藝優(yōu)選

2.4.1 醇沉相對(duì)密度考察

影響醇沉的主要因素有藥液濃縮相對(duì)密度、醇沉濃度[17-20]。預(yù)試驗(yàn)顯示，用60%乙醇所得指標(biāo)成分保留率最高。醇沉工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：稱取處方中水提部分黃芪、酒黃精、制水蛭、清半夏、浙貝母、葶藶子、前胡7味藥各6個(gè)處方量飲片，加10倍量水，加熱回流提取3次，每次1.5 h，趁熱過濾，合并提取液，冷卻備用；稱取6個(gè)處方量化橘紅、當(dāng)歸、連翹3味藥，水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，水液過濾，另器收集，合并上述2份濾液。平行量取濾液4份，每份1700 mL，其中1份作為空白溶液，另3份分別濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10、1.10～1.15、1.15～1.20（60 ℃），加入95%乙醇，調(diào)節(jié)乙醇濃度至60%。冷藏靜置24 h后，將沉淀離心，量取上清液體積，取1/10，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加水復(fù)溶，定容至100 mL容量瓶中，取1 mL，測(cè)定其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量。精密量取1/4醇沉上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用25 mL水復(fù)溶后測(cè)量黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表7?？梢姡瑵饪s至相對(duì)密度為1.05～1.10時(shí)，指標(biāo)成分黃芪甲苷和槲皮素-3-O-β- D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的保留率均最高，故確定醇沉?xí)r濃縮液的相對(duì)密度為1.05～1.10。

2.4.2 醇沉濃度考察

平行量取上述濾液4份，每份1700 mL，其中1份作為空白溶液，均濃縮至相對(duì)密度1.05～1.10，分別用60%、70%、80%乙醇醇沉，結(jié)果見表8。可見，60%乙醇醇沉槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的保留率最高，70%乙醇醇沉黃芪甲苷的保留率最高，60%醇沉和70%醇沉的黃芪甲苷保留率無明顯差異，另結(jié)合大生產(chǎn)及文獻(xiàn)研究[21-25]，選擇醇沉濃度為60%。

2.4.3 醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取處方量藥材，按照優(yōu)選的水提醇沉工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表9。結(jié)果顯示，3批驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，確定醇沉工藝為濃縮至相對(duì)密度1.05～1.10，60%乙醇。

3 討論

本研究以黃芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7- O-β-D-龍膽雙糖苷的提取率及干膏得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化芪蛭益肺顆粒的提取工藝，最終確定最優(yōu)提取工藝為加10倍量水，提取1.5 h，共提取3次。3批驗(yàn)證試驗(yàn)顯示提取工藝準(zhǔn)確，穩(wěn)定可行。另外，以黃芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的保留率為指標(biāo)，最終確定芪蛭益肺顆粒的最優(yōu)醇沉工藝為濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10，用60%乙醇醇沉。3批驗(yàn)證試驗(yàn)顯示醇沉工藝穩(wěn)定可行。

本處方藥味眾多，若以單一成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，不能保證顆粒整體質(zhì)量，故本試驗(yàn)選取3個(gè)指標(biāo)優(yōu)選提取工藝，以確保提取工藝的準(zhǔn)確性和可靠性，考慮到加權(quán)評(píng)分的主觀性，未采用加權(quán)評(píng)分法，而是根據(jù)每個(gè)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，確定最佳提取工藝。本研究數(shù)據(jù)可用于指導(dǎo)制劑生產(chǎn)。

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，葶藶子含量測(cè)定的指標(biāo)成分為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7- O-β-D-龍膽雙糖苷，而文獻(xiàn)報(bào)道以此成分作為正交試驗(yàn)指標(biāo)的研究很少，本研究可為葶藶子在生產(chǎn)中的提取及醇沉工藝提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2017-12-06）

（修回日期：2017-12-26；編輯：陳靜）