黃連素對2型糖尿病大鼠胸主動脈PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響

封 芬 譚安雄 鄧集湘 周 斌

1.邵陽學(xué)院藥學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.湖南省邵陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖南邵陽 422000

[關(guān)健詞]黃連素；糖尿??；大血管病變；血脂；PI3K；Akt；eNOS

目前，糖尿病的患病率持續(xù)增長，2013年，我國成人糖尿病患者已達(dá)人口總數(shù)的10.4%[1]。大血管病變作為糖尿病的主要慢性并發(fā)癥，是患者死亡的主要原因[2]，而血管內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的主要病理表現(xiàn)[3]。近年來的研究顯示，我國傳統(tǒng)中藥黃連素在降血糖、調(diào)血脂等方面具有顯著功效[4-5]，黃連素能改善血管內(nèi)皮功能，減輕動脈球囊引起的血管內(nèi)皮損傷[6]?？v觀國內(nèi)外研究報道，對黃連素保護(hù)糖尿病大血管方面的信號機(jī)制研究較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肌肉因子Irisin、藻酸雙酯鈉納米劑型、紅景天苷等可通過上調(diào)PI3K/Akt/eNOS信號途徑，改善糖尿病血管內(nèi)皮功能[7-9]，故推測黃連素對糖尿病大血管的保護(hù)作用有可能與PI3K/Akt/eNOS信號通路有關(guān)。本實驗從黃連素對2型糖尿病大鼠糖、脂代謝及胸主動脈PI3K/Akt/eNOS信號通路的影響著手，探討其對糖尿病大血管病變的防治機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物和飼料

清潔級 SD 大鼠[60 只，雄性，體質(zhì)量（190±10）g]、普通飼料、高糖高脂飼料（含58.5%普通飼料、20%蔗糖、18%煉豬油、0.5%膽酸、3%膽固醇）均由湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 主要藥物和試劑

黃連素和鏈脲佐菌素為北京北實縱橫科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；鹽酸二甲雙胍為山東東方福瑞達(dá)制藥有限公司產(chǎn)品；p-eNOS（Ser1177）一抗和p-PI3K-p85一抗為 Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；p-Akt（Ser473）一抗、山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；一氧化氮（NO）硝酸還原酶法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PVDF膜和β-actin抗體購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白質(zhì)檢測BCA試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

日立7020型全自動生化分析儀（日本日立高新技術(shù)有限公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀（美國Lifescan公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），垂直電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），SynergyTM HT多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），AlphalmagerTM2200凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.4 動物造模及分組

將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組（n=10）和實驗組（n=50），前者飼喂普通飼料，后者飼喂高糖高脂飼料。4周后大鼠禁食12 h，實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg（用pH為4.4的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解），正常組腹腔注射等量的枸櫞酸緩沖液，7 d后均重復(fù)注射1次。2周后，斷尾取血測空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）， 以 FBG≥11.1 mmol/L視為2型糖尿病大鼠造模成功[10]。將30只2型糖尿病大鼠隨機(jī)分為二甲雙胍組（陽性對照藥）、黃連素組和模型組各 10 只，分別以二甲雙胍[200 mg/（kg·d）]、黃連素[150 mg/（kg·d）]和生理鹽水[10 mg/（kg·d）]灌胃，每天注意觀察大鼠攝食、飲水、排便等情況，繼續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.5 生化指標(biāo)檢測

藥物干預(yù)結(jié)束后禁食12 h，剪尾采血，用血糖儀檢測FBG。然后麻醉大鼠，腹主動脈取血分離血清，-80℃保存，用于檢測一氧化氮（NO）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平。NO按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測，TC、TG、LDL-c、HDL-c 用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.6 胸主動脈形態(tài)學(xué)觀察

腹主動脈取血后即刻分離胸主動脈，剪成兩段，分別予HE染色和-80℃保存。立即將一段胸主動脈予10%中性甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色（HE染色）后觀察顯微鏡下的形態(tài)學(xué)改變。

1.7 免疫印跡法檢測胸主動脈p-PI3K-p85、p-Akt、peNOS等蛋白表達(dá)

取出低溫保存的大鼠胸主動脈，裂解、冰浴勻漿后，低溫高速離心，去除沉淀，BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液后加熱變性。取50 μg蛋白上樣，在10%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳。半干式電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛乳室溫下緩慢輕搖封閉2 h，加入一抗后于4℃孵育過夜。次晨TBST洗膜，10 min/次，共3次。加入二抗，室溫緩慢輕搖孵育40 min，TBST洗膜，15 min/次，共3次。暗室內(nèi)加入超敏發(fā)光劑，X線膠片曝光。用AlphalmagerTM2200凝膠成像系統(tǒng)分析p-PI3K-p85、p-Akt、p-eNOS 等蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間大鼠情況

正常組大鼠體質(zhì)量漸增，皮毛潤滑，攝食飲水量適中，大小便及活動正常。模型組大鼠體質(zhì)量漸減，毛色枯黃，攝食飲水量及小便增多，精神萎靡懶動。二甲雙胍組和黃連素組大鼠糖尿病癥狀輕于模型組。

2.2 各組大鼠FBG及血清NO水平的比較

模型組大鼠的FBG水平高于正常組，血清NO水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；黃連素組及二甲雙胍組的FBG水平低于模型組，血清NO水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（表 1）。

表1 各組大鼠FBG和血清NO水平的比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠FBG和血清NO水平的比較（n=10，±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別 劑量（mg/kg） FBG（mmol/L） NO（μmol/L）正常組模型組二甲雙胍組黃連素組--200 150 4.87±1.14 25.23±4.01*11.18±3.01*△13.75±2.84*△35.72±4.35 20.07±3.30*29.02±3.98*△26.56±4.48*△

2.3 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較

模型組的TG、TC、LDL-c水平高于正常組，HDL-c水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。黃連素組及二甲雙胍組的TG、TC、LDL-c水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。黃連素組的TC水平高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表 2）。

表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比較（n=10，±s）

與正常組比較，#P＜0.05，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與二甲雙胍組比較，▲P＜0.05

組別 劑量（mg/kg）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-c（mmol/L）HDL-c（mmol/L）正常組模型組二甲雙胍組黃連素組--200 150 0.71±0.13 2.22±0.30*1.86±0.25*△1.92±0.20*△1.32±0.11 3.86±0.32*2.56±0.31*△2.82±0.21*△▲1.08±0.11 2.63±0.28*1.76±0.28*△1.94±0.30*△1.11±0.10 0.75±0.09*0.96±0.08#*△0.89±0.08*△

2.4 大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)觀察

正常組大鼠胸主動脈中膜層彈力板與平滑肌細(xì)胞排列有序，內(nèi)膜平整光滑。模型組內(nèi)膜不連續(xù)且明顯增厚，并有內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落現(xiàn)象。二甲雙胍組和黃連素組病變程度明顯輕于模型組，內(nèi)膜較光滑平整，內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落較少（圖1）。

圖1 各組大鼠胸主動脈形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200×）

2.5 大鼠胸主動脈p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt蛋白表達(dá)

模型組胸主動脈的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表達(dá)低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；黃連素組和二甲雙胍組胸主動脈的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表達(dá)高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組大鼠胸主動脈p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt等蛋白的表達(dá)

3 討論

黃連素具有顯著的抑菌作用，常用于治療細(xì)菌性胃腸炎。近年來報道，黃連素也具有內(nèi)分泌及心血管系統(tǒng)方面的藥理作用[10]。黃連素能明顯降低糖尿病大鼠餐后血糖及空腹血糖[11]，能降低高脂血癥大鼠血脂水平[12]。本實驗通過腹腔注射鏈脲佐菌素，結(jié)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)的方法建立2型糖尿病大鼠模型[13]。黃連素組大鼠經(jīng)黃連素治療后，糖尿病癥狀明顯減輕。與模型組大鼠相比，黃連素組的FBG、TG、TC、LDL-c水平明顯降低，HDL-c 水平明顯升高（P＜0.01），提示黃連素具有較好的降血糖及調(diào)血脂作用，與國內(nèi)外報道相似。

NO為血管舒張因子，是反映血管內(nèi)皮功能的常用指標(biāo)。研究顯示，糖尿病、高血脂可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損，NO合成分泌減少[14]，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是糖尿病大血管病變的關(guān)鍵觸發(fā)因素[3]。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠胸主動脈內(nèi)膜受損明顯，血清NO水平明顯低于正常組，而 FBG、TC、TG、LDL-c 水平明顯高于正常組（P＜0.01），提示在高糖高脂的刺激下，2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了大血管病變。與模型組相比，黃連素組大鼠的血清 NO 水平升高，血糖、血脂水平降低（P＜0.01），胸主動脈內(nèi)皮病變改善，提示黃連素可能通過改善糖脂代謝，緩解血管內(nèi)皮受損，保護(hù)糖尿病大血管。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成的異二聚體[15]。Akt是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信號通路與糖代謝、細(xì)胞增殖、分化等生命活動密切相關(guān)[16]。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （endothelin nictric oxide synthase，eNOS）是合成NO的限速酶，為內(nèi)皮功能完整的標(biāo)志之一[17]。研究顯示，脂肪因子vaspin可通過激活PI3K/Akt/eNOS途徑改善高葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮組細(xì)胞功能障礙[18]；6-姜酚可通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，減輕高葡萄糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[19]。上述研究均提示PI3K/Akt/eNOS信號通路與調(diào)控血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)。據(jù)報道，黃連素可通過激活PI3K/Akt/eNOS通路，改善TNF-α引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞受損[20]。本實驗中，模型組大鼠胸主動脈的p-PI3K-p85、p-Akt和p-eNOS等蛋白表達(dá)低于正常組（P＜0.01），而黃連素組高于模型組（P＜0.01），故推測黃連素可通過激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑，保護(hù)大血管內(nèi)皮功能。

綜上所述，黃連素能保護(hù)2型糖尿病大鼠大血管，減輕內(nèi)皮病變程度，可能與改善糖脂代謝和激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑有關(guān)。本實驗僅對此信號途徑進(jìn)行了初步探討，關(guān)于黃連素對糖尿病大血管的保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，以期為控制和延緩2型糖尿病大血管病變提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。