四種抗生素對果蠅學(xué)習(xí)記憶影響及其分子機(jī)理研究

葛仟鴻 楊遠(yuǎn)媛 杜書文

（北京市第三十五中學(xué)，北京 100035）

抗生素是一種能夠殺死或者抑制細(xì)菌生長的藥物。常用的抗生素包括: β-內(nèi)酰胺類，氨基糖苷類，利福霉素類和四環(huán)素類?？股仉m能有效抑菌或殺菌，但其濫用也會造成很多負(fù)面作用。抗生素的濫用不僅會導(dǎo)致超級耐藥菌產(chǎn)生，也會對大腦功能產(chǎn)生損害?；旌峡股貢档托∈笮律窠?jīng)元的數(shù)量并影響小鼠記憶功能。向發(fā)育期的Sprague Dawley (SD)鼠腹腔注射青霉素會損傷學(xué)習(xí)記憶功能。利福平被認(rèn)為能在急性腦梗中保護(hù)神經(jīng)元。多西環(huán)素能顯著地減弱恐懼記憶的遺忘速度。腹腔注射慶大霉素會導(dǎo)致小鼠下丘核中的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophin-3,NT-3)表達(dá)量顯著性降低，該結(jié)果被認(rèn)為是解釋慶大霉素導(dǎo)致耳中毒(Ototoxicity)的原因。認(rèn)知功能包括很多方面，例如學(xué)習(xí)功能，記憶功能還有記憶靈活性，而抗生素對多種認(rèn)知功能的作用評價(jià)鮮有報(bào)道。果蠅作為一種模式生物被廣泛的應(yīng)用于認(rèn)知功能機(jī)理探索。

本研究將利用果蠅探索了臨床常用但屬于不同類型的四種抗生素(青霉素鉀、慶大霉素、利福平和鹽酸多西環(huán)素)對嗅覺學(xué)習(xí)能力、記憶能力和認(rèn)知靈活性的影響并對分子機(jī)理進(jìn)行初步探索，為進(jìn)一步認(rèn)識不同抗生素對認(rèn)識功能的影響提供線索。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系

本研究采用白眼、直翅的野生型w(isoCJ1)作為動物模型。所有測試果蠅的均飼養(yǎng)在恒溫24℃, 恒濕42% RH的蠅房中，并保持12小時(shí)/12小時(shí)晝夜控制，保證果蠅正常節(jié)律。

1.2 抗生素配制與給藥

四種抗生素均避光室溫保存。在給藥當(dāng)天，分別秤取125mg或250mg抗生素用于配制低和高濃度實(shí)驗(yàn)藥物溶液。4%蔗糖溶液(含0.5% Tween80)作為溶媒。給藥方式是將藥液滴加到塑料管中的濾紙上，果蠅通過吮吸濾紙上藥液給藥。本實(shí)驗(yàn)中分別用KS1、KS2、KS3、KS4代表青霉素鉀、利福平、鹽酸多西環(huán)素和慶大霉素。

圖1 高濃度給藥下果蠅壽命曲線

圖2 低濃度給藥下果蠅壽命曲線

圖3 學(xué)習(xí)能力，記憶能力和認(rèn)知靈活性測試范式

圖4 果蠅學(xué)習(xí)能力測試

圖5 果蠅記憶能力測試

1.3 果蠅嗅覺學(xué)習(xí)和記憶測試方法

將約100只果蠅裝入帶有導(dǎo)電銅網(wǎng)的訓(xùn)練管，按照先后順序通入3-octanol(OCT)和4-methylcyclohexanol (MCH)兩種不同的氣味，在通第一個(gè)氣味(CS+)時(shí)，訓(xùn)練管的銅網(wǎng)通電(US)，果蠅被電擊；當(dāng)通第二個(gè)氣味時(shí)(CS-)，銅網(wǎng)不通電。該過程稱為訓(xùn)練。在學(xué)習(xí)能力、1小時(shí)記憶能力和記憶靈活性評價(jià)測試中，訓(xùn)練后的果蠅分別在訓(xùn)練后5分鐘、60分鐘以及兩個(gè)連續(xù)訓(xùn)練之后的5分鐘后被迅速導(dǎo)入T-maze中。T-maze的兩端分別同時(shí)通入OCT和MCH，果蠅對兩種氣味進(jìn)行選擇。果蠅行為指數(shù)是用選對(CS+)的果蠅的數(shù)量減去選錯(cuò)果蠅(選CS-)的數(shù)量，除以兩者總果蠅數(shù)量并乘以100%。

圖6 果蠅認(rèn)知靈活性測試

圖7 氣味分辨能力測試

圖8 生化檢測KS1和KS4對PKC和Rac影響

1.4 果蠅氣味辨別測試訓(xùn)練

將沒有經(jīng)過伴隨電擊訓(xùn)練的果蠅直接放入T-maze中，一側(cè)通入空氣，另一側(cè)通入OCT或MCH氣體。根據(jù)給藥組與對照組果蠅選擇空氣端的數(shù)量計(jì)算出行為，并依據(jù)行為指數(shù)判斷果蠅辨別氣味的能力是否因給藥而受到損傷。

1.5 蛋白印記實(shí)驗(yàn)

給藥后24小時(shí)的果蠅(每組約600只)收集并放入液氮20秒，之后取出震蕩過篩收集果蠅頭部。之后加入裂解液并進(jìn)行研磨。研磨液經(jīng)過12000rpm 4℃離心20分鐘，上清液保存在-20℃。配制15%的SDSPAGE膠，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白印記實(shí)驗(yàn)?？贵w信息：Anti-Actin (1:8000)購自拜爾迪，PKC(1:2000)和磷酸化PKC(1:4000)購自BD, Rac1總蛋白(1:4000)購自Cytoskeleton LLC, PAK-beads購自Cytoskeleton LLC。激活的Rac1 (Rac1-GTP)檢測采用之前報(bào)道方法。二抗分別采用Mouse-HRP和Rabbit-HRP(購自拜爾迪)，ECL發(fā)光液購自Millipore。條帶分析采用Image-J，數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6版本。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)中的分析采用student’s T-test，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001。n.s代表無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖9 KS1和KS4對PKC磷酸化水平影響

圖10 KS1和KS4對Rac激活水平影響

2 結(jié)果

2.1 125mg/mL是最佳給藥濃度和給藥24小時(shí)是最佳給藥時(shí)間

為模擬抗生素過量所導(dǎo)致的影響。在不影響果蠅壽命的前提下，我們給予果蠅足量的藥量以及足夠長的藥物暴露時(shí)間。因此，首先探索高濃度藥液(250mg/mL)對果蠅壽命的影響。結(jié)果如圖1所示，高濃度(250mg/mL)組中，所有果蠅在給藥后4小時(shí)均未出現(xiàn)死亡。給藥24小時(shí)之后，對照組(Ctrl)中95%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是75%，100%，100%和75%。給藥48小時(shí)后，對照組中75%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是30%，95%，25%和10%。說明果蠅在長時(shí)間(＞24小時(shí))攝取高劑量抗生素對壽命有影響，而短期(4小時(shí)) 給藥沒有影響。為了讓果蠅有較長的藥物暴露時(shí)間，我們又進(jìn)行低濃度藥液對果蠅壽命影響的實(shí)驗(yàn)。在低濃度(125mg/mL)給藥實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果如圖2所示，所有實(shí)驗(yàn)組在給藥后4小時(shí)均未出現(xiàn)果蠅死亡，在給藥24小時(shí)之后，僅對照組果蠅出現(xiàn)5%數(shù)量死亡，所有抗生素組均未出現(xiàn)果蠅死亡。在給藥48小時(shí)之后，對照組有75%的果蠅存活，KS1-KS4組的存活率分別是40%，95%，80%和15%。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用125mg/mL濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度，24小時(shí)作為給藥時(shí)長，原因是在該濃度和該給藥時(shí)間內(nèi)，所有果蠅均攝取了抗生素溶液并且無明顯壽命影響。

2.2 四種抗生素對果蠅學(xué)習(xí)能力的影響

本研究首先檢測了果蠅在給藥24小時(shí)(125mg/mL)濃度下，對于嗅覺學(xué)習(xí)能力的影響。行為范式如圖3C1所示，結(jié)果如圖4所示，健康對照組(Ctrl)的學(xué)習(xí)行為指數(shù)是78，而KS1-KS4的學(xué)習(xí)行為指數(shù)分別是69，79，70和59。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)KS4與健康對照組相比，學(xué)習(xí)能力顯著性下降(p=0.0048)，而其他抗生素均不對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生影響。

2.3 四種抗生素對果蠅1小時(shí)記憶能力的影響

記憶能力測試行為范式如圖3中C2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，健康對照組(Ctrl)的60分鐘記憶指數(shù)是55，而KS1-KS4的學(xué)習(xí)指數(shù)分別是75，65，57和58。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)KS1與健康對照組相比，1小時(shí)記憶能力顯著性增強(qiáng)(p=0.0035)，而其他抗生素均不對果蠅嗅覺記憶能力產(chǎn)生影響。

2.4 四種抗生素對果蠅認(rèn)知靈活性的影響

記憶的靈活性是認(rèn)知功能的重要指標(biāo)，多種自閉癥相關(guān)基因突變均會降低記憶的靈活性。本研究通過反轉(zhuǎn)訓(xùn)練(Reverse Training)的范式對記憶靈活性進(jìn)行檢測如1C3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示健康對照組果蠅的行為指數(shù)是54.5，KS1-KS4組的行為值分別是42，49，54,和48。所有給抗生素組的果蠅均表現(xiàn)出與健康對照組無差異的行為值。

2.5 KS4不影響果蠅的嗅覺功能

從學(xué)習(xí)能力測試發(fā)現(xiàn)，KS4(慶大霉素)會損傷果蠅的嗅覺學(xué)習(xí)能力，為了排除KS4不是通過損傷了果蠅的嗅覺系統(tǒng)功能而產(chǎn)生了嗅覺學(xué)習(xí)能力降低的結(jié)果，我們檢測了KS4給藥組對氣味的分辨能力(方法如1.4所述)。結(jié)果顯示相比于對照組，KS4并不影響果蠅對OCT和MCH氣味的辨別能力(圖7)，因此可以確定KS4造成的學(xué)習(xí)功能損傷有由于學(xué)習(xí)相關(guān)分子機(jī)制改變導(dǎo)致的。

2.6 KS4損傷學(xué)習(xí)能力，KS1促進(jìn)記憶維持的分子機(jī)理研究

蛋白激酶C (the protein kinase C, PKC)在跨膜信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著極為重要的作用，因此被認(rèn)為“記憶激酶”。諸多證據(jù)都表明它參與記憶的獲取和維持，降低PKC的磷酸化水平會導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力損傷，而增強(qiáng)PKC磷酸化水平能夠促進(jìn)提高學(xué)習(xí)能力和記憶維持。行為實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KS4會損傷果蠅學(xué)習(xí)能力，因此通過蛋白印記檢測KS4給藥后果蠅大腦中總PKC和PKC磷酸化水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KS4給藥24小時(shí)之后，果蠅大腦中PKC蛋白磷酸化水平顯著下降(圖8代表性生化結(jié)果，圖9為統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，但KS4不改變總PKC的含量，因此說明KS4可能通過產(chǎn)生降低PKC磷酸化水平導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力下降。我們還檢測了KS1給藥24小時(shí)之后對果蠅的PKC活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KS1不影響PKC磷酸化水平和總PKC含量(圖9)，由此得出KS1增強(qiáng)果蠅一小時(shí)記憶不通過PKC分子通路。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)小G蛋白Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)參與記憶遺忘調(diào)控，Rac1-GTP是Rac1的激活態(tài)，持續(xù)激活Rac1會促進(jìn)記憶的遺忘，而抑制Rac1活性能抑制遺忘。我們檢測了KS1和KS4在給予果蠅24小時(shí)之后，果蠅大腦中Rac1活性的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KS1和KS4均不影響影響Rac1激活態(tài)和總Rac1的含量(圖8代表性生化結(jié)果，圖10為統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。

3 結(jié)語

本研究利用果蠅模型，探索了四種不同抑菌機(jī)制的抗生素對果蠅嗅覺學(xué)習(xí)能力，記憶能力和認(rèn)知靈活性的影響。通過果蠅行為實(shí)驗(yàn)和生化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：（1）過量及長時(shí)間攝入抗生素對壽命有一定的損傷，但我們意外發(fā)現(xiàn)利福平(KS2)在壽命實(shí)驗(yàn)中，能起到一定的壽命延長的作用(圖1和圖2)，有研究認(rèn)為利福平有保護(hù)神經(jīng)元的功能。（2）低劑量慶大霉素會通過抑制PKC磷酸化導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力下降。在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)慶大霉素會導(dǎo)致小鼠下丘核中的神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)量顯著性降低。（3）低劑量青霉素鉀能促進(jìn)果蠅1小時(shí)記憶的維持，生化實(shí)驗(yàn)證明其增強(qiáng)記憶維持功能不是通過提高PKC磷酸化及抑制遺忘分子Rac激活，而是通過其他分子通路。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群會參與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)，抗生素會通過改變腸道菌群的種類和數(shù)量影響大腦神經(jīng)生長因子，本研究結(jié)合果蠅行為學(xué)對四種常用抗生素對認(rèn)知功能的影響進(jìn)行了探索，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索。