奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥性研究進展

趙艷坤 劉慧敏 王帥 蔡建星 王成 陳賀

（1. 新疆農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所 農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室 新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊830091；2. 農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室，北京 100193）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）是一種革蘭氏陽性菌，在世界范圍內被稱為侵襲性病原菌，是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一，感染率達50%以上［1］。S.aureus性乳房炎主要致病機理是侵入奶牛乳腺組織后，定殖和黏附于乳腺上皮 細 胞（Mammary epithelial cells，MECs）［2］， 損害MECs和腺泡功能［3］，還可出現(xiàn)乳腺膿腫、硬化或瘺管，嚴重者會出現(xiàn)乳腺的壞死和脫落，一旦感染很難治愈［4］，不僅影響產奶量和乳品質，造成巨大經濟損失，甚至危及人類健康。近年來，隨著抗菌藥物在臨床和畜牧業(yè)的濫用，S.aureus耐藥性問題日趨嚴重，出現(xiàn)了多重耐藥（Multidrug-resistant，MDR）菌株及超級細菌-耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA），其MDR和泛耐藥（Pan-drug resisitance，PDR）引起了國內外專家學者廣泛關注［5］。據(jù)報道，全球MRSA的檢出率為18.4%-82.9%，我國MRSA平均檢出率為47.9%［6］，MRSA 90%以上是MDR菌株［7］。目前，細菌耐藥性問題已成為全世界共同關注的焦點，中國政府也十分重視抗菌藥物臨床合理使用和細菌耐藥問題。2018年，為貫徹十九大精神，全國堅持實施優(yōu)質乳工程，而在十三屆全國人大一次會議中，農業(yè)部表示將狠抓細菌耐藥性問題。現(xiàn)階段，在抗菌藥物選擇的壓力下，新的S.aureus耐藥機制不斷出現(xiàn)，且伴隨著耐藥基因在菌體間的轉移，使得S.aureus性奶牛乳房炎難以使用1種抗菌藥物或不同化學成分的抗菌藥物聯(lián)合治療。目前，乳制品和獸醫(yī)業(yè)對奶牛臨床治療的現(xiàn)狀要求限制S.aureus耐藥性傳播，并迫切需要開發(fā)不被現(xiàn)有耐藥機制覆蓋的新抗菌藥物。因此，本文分析S.aureus耐藥性現(xiàn)狀，并結合S.aureus耐藥基因以闡明其耐藥機制，旨為S.aureus性奶牛乳房炎臨床治療用藥及新型藥物研發(fā)提供理論參考，同時響應十九大精神對整個奶牛養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展具有重大意義。

1 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀

S.aureus產生耐藥的根本原因是抗菌藥物的大量使用，且抗菌藥物使用時間越長，其越容易產生耐藥性，兩者呈正相關［8］。丹麥于1963年最早發(fā)現(xiàn)了人類耐甲氧西林且mec基因陽性的金黃色葡萄球菌菌株（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）［9］。1975年，比利時首次從奶牛乳房炎中分離出MRSA［10］。近年來，隨著S.aureus和MRSA的流行傳播，其泛耐藥性給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的威脅，因此在全球備受關注。

1.1 國外奶牛乳房炎源S.aureus耐藥現(xiàn)狀

S.aureus具有廣譜耐藥和多種耐藥特性（表1）。2011-2018年近10年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，國外對奶牛乳房炎中S.aureus、MRSA的分離率因地域性差異浮動較大，2011-2014年MRSA的分離率不是很高，但近幾年有增加的趨勢；S.aureus對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類及大環(huán)內酯類等常見類型抗菌藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥，耐藥性變化趨勢為：β-內酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類及氨基糖苷類耐藥性明顯上升；大環(huán)內酯類略有上升；喹諾酮類耐藥性沒有明顯變化。值得一提的是，2015年南非西北部發(fā)現(xiàn)S.aureus對萬古霉素的耐藥率高達68.79%；2018年，阿拉伯北部發(fā)現(xiàn)S.aureus對氯霉素耐藥率達13.7%，而在此之前對其均表現(xiàn)敏感，說明S.aureus耐藥菌株逐漸增多，但其區(qū)域性差異巨大。同時，奶牛乳房炎S.aureus的MDR（30.9%-100%）現(xiàn)象嚴重，近兩年分離的S.aureus均為MDR（100%）。

1.2 國內奶牛乳房炎源S.aureus耐藥現(xiàn)狀

查閱近年來我國奶牛主要養(yǎng)殖區(qū)域或乳房炎高發(fā)地區(qū)的S.aureus耐藥性相關資料并進行整理，總結我國各地區(qū)耐藥率高低如下：新疆：PG＞AMP＞ERY＞ 克林霉素（Clindamycin，CLI）＞TET＞SXT；內蒙古：ATM＞氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）＞AMP＞SXT＞ERY；寧夏：PG＞AMP＞ERY＞SXT；天津：PG＞CEF＞ERY＞TET＞ 甲氧西林（Methoxicillin，MET）＞CLI＞林可霉素（Lincomycin，LNY）；河北：磺胺異惡唑（Sulfonazo isoxazole，SIZ）＞AMP＞甲氧胺嘧啶（Methoxamine pyrimidine，TMP）＞SXT＞阿 莫 西 林（Amoxicillin，AMC）＞強力霉素（Doxycycline，DO）＞ERY＞克拉霉素（Clarithromycin，CLR）＞LNY＞阿奇霉素（Azithromycin，AZM）；山東：PEN＞諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）＞恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）＞卡那霉素（Kanamycin，K）＞鏈霉素（Streptomycin，SM）＞GM＞ERY；黑龍江：PG＞AMP＞SXT；江蘇：PG＞AMP＞SXT＞SM＞K＞ERY＞TET＞CLI；上海 ：PG＞AMP＞SXT＞ERY ； 安 徽 ：PG＞AMP＞SXT＞ERY＞CLI；浙江：PEN＞AMP＞SXT；河南：PG＞AM0＞AMP＞SXT；陜西：PG＞AM0＞AMP＞SM。假設同一地區(qū)大于70%的S.aureus分離株對某種藥物敏感度認定為該區(qū)S.aureus菌株對此藥敏感，我國新疆［20］、內蒙古［21］、黑龍江［22］、寧夏［23］、陜西［24］、四川［25］、天津［26］、河北［5］、安徽［27］、上海［28］等 14 個地區(qū)分離的牛源S.aureus對PG、AMP和SXT均表現(xiàn)出極強的耐藥性；大部分省區(qū)分離株對ERY耐藥；新疆、天津、江蘇地區(qū)的S.aureus分離株對TET耐藥，其他省區(qū)對其表現(xiàn)介于耐藥與敏感之間；新疆、天津、安徽、四川和江蘇分離株對CLI耐藥；河南和陜西分離株對AMO耐藥性較強；其中河北地區(qū)S.aureus耐藥菌株最多，對10種抗菌藥物表現(xiàn)不同程度耐藥，說明我國奶牛乳房炎分離的S.aureus菌株耐藥性種類較多，多耐性較廣泛。結合表1，世界范圍內奶牛乳房炎S.aureus耐藥及MDR普遍存在。我國與世界其他地區(qū)研究結果一樣，不同地區(qū)分離的S.aureus菌株對各類常見抗菌藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥性，但地區(qū)與地區(qū)之間S.aureus耐藥菌株差異較大，進一步說明S.aureus耐藥性可能具有一定區(qū)域性。S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性最嚴重，這也與國外研究結果一致，說明β-內酰胺類仍然是治療奶牛乳房炎使用最廣泛的一類抗菌藥物，導致S.aureus菌株在世界范圍內對其高度耐藥，符合世界性觀察到的S.aureus耐藥性普遍趨勢。

表1 2011-2018 年奶牛乳房炎S.aureus 對10 種常見抗菌藥物耐藥性［11-19］

事實上，S.aureus菌株的耐藥性越來越強，已經發(fā)展出廣譜的抗菌藥物抗性機制，這意味著隨著耐藥性的不斷發(fā)展，新的耐藥機制將會不斷地出現(xiàn)，且變得更為復雜，必定導致S.aureus對臨床所用抗菌藥物的耐藥程度日漸嚴重，加劇臨床治療難度。

2 奶牛乳房炎金S. aureus耐藥機制

S.aureus的耐藥性機理復雜，總結主要有以下幾種：（1）酶失活；（2）主動外排系統(tǒng)；（3）保護、改變、更換抗菌藥物靶位點；（4）基于質?；蛉旧w上的耐藥基因介導的S.aureus耐藥機制?，F(xiàn)階段，由基因編碼介導的S.aureus分子耐藥機制成為各國相關學者研究熱點。

2.1 S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制主要有以下兩種：（1）質粒介導的獲得性耐藥。S.aureus菌株由耐藥因子生成了β-內酰胺酶，此酶附著在細菌表面，經質粒介導，通過胞外β-內酰胺類藥物的水解，致使產酶株與非產酶株相比抗菌藥物的活性降低或消失，導致S.aureus對β-內酰胺類藥物產生耐藥；（2）藥物結合位點的改變或形成新的青霉素結合蛋白（Penicillin binding protein，PBP）介導的固有耐藥。PBPs是構成S.aureus細胞壁形成的重要蛋白酶系統(tǒng)，也是β-內酰胺類抗菌藥物與S.aureus菌體的結合靶位點，與其具有較高親和力。當環(huán)境藥物濃度達到最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）時，β-內酰胺類藥物與PBPs結合，使其乙酰化，導致轉肽酶（Transpeptidase，TPase）失活，便會讓細菌難以形成細胞壁，從而導致敏感菌死亡［29］。

PBPs的改變是S.aureus對β-內酰胺類藥物耐藥的重要機制［30］。PBPs在MRSA對苯唑西林的耐藥程度中發(fā)揮至關重要的作用。β-內酰胺酶、PBPs的過量表達可導致MRSA的低水平耐藥，PBPs與苯唑西林的親和力也是MRSA低水平耐藥的原因之一；而PBP2a的存在則導致MRSA高水平耐藥，與其他PBPs不同，PBP2a與β-內酰胺類藥物親和力極低甚至不與其結合，致使MRSA高水平耐藥。而mecA是PBP2a的編碼基因，MRSA的分子耐藥機制與mecA基因密切相關。總結有以下兩種。

mecA是MRSA的耐藥決定子，MRSA的mecA基因通過轉座子的移動得到外來基因，該基因大量表達使S.aureus對甲氧西林耐藥的產物PBP2a合成。另有資料表明，作為MRSA耐藥輔助基因的fem型基因在細菌細胞壁生成環(huán)節(jié)至關重要，其中femA、femB這兩種基因在S.aureus對β-內酰胺類藥物耐藥方面具有重大影響［31］。據(jù)報道，β-內酰胺類抗菌藥物針對MRSA的抗藥性或可由femA、femB的失活導致，以此同時也造成了其他多種類抗菌藥對MRSA的敏感性大幅提升［32］。2014年，萬艷紅［33］在51株MRSA菌株中發(fā)現(xiàn)mecA、femA基因檢出率均為100%；另有研究對河南地區(qū)180株MRSA菌株進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有168株mecA基因陽性（符合率為93.3%），且多為MDR菌株［34］。MSRA產生的高耐藥性，實質上是由fem基因協(xié)同mecA基因產生的表型，但當mecA與fem其中一方失活后，這一效果便大打折扣。在fem基因失活的前提下，盡管PBP2a可由mecA單獨編碼產生，但偶見細菌仍出現(xiàn)高度耐藥現(xiàn)象［35］。由于mecA和femA基因在MRSA對苯唑西林等β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要地位，且其主要存在于耐藥菌中，因此，國際上通常檢測mecA和femA兩個基因以判定S.aureus對甲氧西林抗菌藥物是否耐藥。

S.aureus的耐藥性可能與其細胞壁的形成相關，而PBP2a可能會加速該現(xiàn)象出現(xiàn)，即使相關PBPs活性在β-內酰胺類藥物干預結合下而降低，這一現(xiàn)象仍會發(fā)生。實驗表明，PBP2a不會單方面促成β-內酰胺類抗菌藥物對MRSA的耐藥性，若沉默PBP2基因，可降低對甲氧西林的耐藥程度［36］；另外，阻斷PBP2的TGase活性時，抗菌藥物的存在致使PBP2抑制TPase活性，PBP2a則可恢復TPase活性，實現(xiàn)細菌肽聚糖合成與細胞壁骨架搭建［37］。由此可知，MRSA的耐藥性是其細胞壁上合成了相關肽聚糖，而PBP2a則協(xié)同PBP催化了該過程。

2.2 S.aureus對四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥機制

在對S.aureus測序后發(fā)現(xiàn)，其基因序列中包含了滅活酶基因、排外基因、核糖體保護基因及未明機制的基因等。共40多種耐藥性基因，而這些耐藥性基因均指向四環(huán)素類藥物，這就揭示了S.aureus對四環(huán)素類抗菌藥物耐藥的本質［38］。在系列針對耐四環(huán)素類藥物的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)研究主要著力在主動排外基因和核糖體保護基因等基因，TetK、TetO、TetL、TetA及TetC等基因均包含于此。其中在奶牛源葡萄球菌中介導四環(huán)素耐藥的基因主要為TetL和TetK，TetM和最為罕見的TetO也在牛源葡萄球菌中被檢出。國外有學者利用PCR技術檢測對S.aureus中可能存在的耐四環(huán)素抗菌藥物基因片段發(fā)現(xiàn)：在分離的90株S.aureus中，TetK基因的檢出率為84%，TetL基因為9%，TetM為2%，TetO僅為1%［39］。這些耐藥基因能夠產生介導四環(huán)素耐藥的保護蛋白，以質粒或轉座子為媒介在各個菌體間快速地產生、擴散著對此類抗菌藥物的耐藥性。

2.3 S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制主要有以下3種：（1）藥物結合位點的改變。發(fā)生基因突變現(xiàn)象，致使藥物無法發(fā)揮抑菌或殺菌作用而形成耐藥；（2）膜屏障的改變或主動外排作用。減少此類抗菌藥物的吸收或阻止藥物進入細菌內而產生耐藥；（3）氨基糖苷修飾酶（Aminoglycosides modifying enzyme，AMEs）的修飾鈍化作用。AMEs通過修飾此類抗菌藥物的特定基團，使其降低或失去對靶位核糖體的親和力而喪失生物活性，從而產生耐藥性。這是S.aureus對該類藥物產生耐藥的主要機制。研究發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因中，氨基糖苷乙酰轉移酶（Aminoglycoside acetyltransferases，AAC）6′和氨基糖苷磷酸轉移酶（Aminoglycosidephosphotransferases，APH）2′′基 因分別編碼雙功能酶AAC6′和APH2″，這兩種編碼基因可使S.aureus對GM、K、丁胺卡那（Amikacin，AMK）、妥布霉素（Tobramycin，TM）和奈替米星（Netilmicin，NET）等產生耐藥性［40-41］；Turutoglu 等［42］從奶牛乳房炎分離出了18株MRSA菌株，進行PCR耐藥基因檢測及序列分析發(fā)現(xiàn)，有3株mecA陽性基因編碼耐甲氧西林，并證明了這3株菌株存在AAC6′、APH2″、APH3′等基因編碼的氨基糖苷類耐藥，表明攜帶氨基糖苷類修飾酶基因的3株菌株對慶大霉素、卡那霉素和新霉素耐藥；徐佳［43］對奶牛乳房炎葡萄球菌種類及耐藥性研究表明，32.1%的S.aureus為AACA、APHD基因檢測陽性，證實了表達AAC6′、APH2″是S.aureus對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因；Crossman等［44］學者在對S.aureus全基因組的研究中發(fā)現(xiàn)，S.aureus帶有多種擬多重耐藥轉運蛋白基因。目前，國內外相關報道罕見，其功能和具體作用機制尚未明確，尚需進一步研究。

2.4 S.aureus對大環(huán)內酯、林可胺類（Macrolides lincosamides，MLs）抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對MLs抗菌藥物的耐藥機制主要有3種：（1）藥物活性被鈍化；（2）藥物與菌體的作用位點突變；（3）菌體內形成了主動轉運藥物系統(tǒng)。

多項研究表明，紅霉素核糖體甲基化酶（Erythromycin ribosome methylase，erm）基因、msr基因是介導MLs抗菌藥物耐藥的兩個主要基因。S.aureus染色體或質粒上攜帶erm、msr基因，分別編碼核糖體甲基化酶和轉運蛋白［45］，這兩種編碼基因通過修改抗菌藥物與菌體的結合位點，抑制MLs類抗菌藥物，從而使得S.aureus對MLs抗菌藥物耐藥［46］。其中erm基因是介導S.aureus對MLs抗菌藥物產生廣泛耐藥的主要原因，erm基因表達及其上游啟動子出現(xiàn)突變均可致使MLs產生耐藥，當核糖體蛋白L4和大亞基的23S rRNA堿基突變而抑制該類藥物與核糖體靶位點結合，也可導致MLs抗菌藥物耐藥［47］；而msrA和msrC基因編碼的主動泵出系統(tǒng)可將MLs抗菌藥物從細胞中排出，以保持細胞內低濃度MLs藥物水平。報道稱，msrC基因在介導S.aureus對紅霉素高水平耐藥中發(fā)揮重要作用［48］。

erm、msr基因已被證實在牛源S.aureus中檢出。Kot等［49］研究表明，奶牛乳房炎中S.aureus檢出率16.4%，其中15.6%對MLs抗菌藥物產生了耐藥性，對其抗性基因檢測得出，ermA、ermB和ermC的檢出率分別是14.8%、11.1%和55.5%；2018年，最新研究表明，牛源奶酪被認為是抗菌藥物耐藥基因的儲存庫，S.aureus分離率為4.3%，16S rRNA基因的DNA序列鑒定結果顯示，耐藥基因msrA攜帶率為60.9%，msrB攜帶率為46.6%［50］。說明S.aureus及MLs耐藥基因分離率因地域性不同差異較大。

2.5 S.aureus對喹諾酮抗菌藥物的耐藥機制

S.aureus對喹諾酮類抗菌藥物（Quinolone antibiotics）耐藥的機制主要有3種：（1）藥物靶酶及編碼基因的突變。DNA促旋酶和拓撲異構酶IV是喹諾酮類藥物對S.aureus發(fā)揮抗菌作用的靶酶，grlA和grlB基因編碼DNA促旋酶，grlA、grlB和parC基因編碼拓撲異構酶IV［51］。李曉娜等［52］報道220株奶牛乳房炎S.aureus菌株中grlA基因、gyrA基因和norA基因的檢出率分別為80%、78.64%和78.18%，說明奶牛乳房炎S.aureus攜帶喹諾酮類藥物耐藥基因，這些基因位點的突變可引起喹諾酮類藥物作用的靶位改變，從而導致S.aureus對喹諾酮類藥物耐藥。但不同結構的喹諾酮類藥物對S.aureus的作用位點不同。苗貝貝等［53］通過研究左氧氟沙星、莫西沙星和奈諾沙星3種喹諾酮類藥物對S.aureus耐藥突變體的體外抗菌活性發(fā)現(xiàn)，左氧氟沙星優(yōu)先作用于S.aureus拓撲異構酶Ⅳ靶位parC基因，而莫西沙星和奈諾沙星則幾乎同時作用于S.aureusDNA促旋酶靶位grlA基因和拓撲異構酶Ⅳ靶位parC基因。該類藥物耐藥性與這些靶位酶基因密不可分，統(tǒng)稱為喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance-determining regions，QRDR）基因 ；（2）主動外排系統(tǒng)。主要為norA、norB、norC基因介導的主動外排系統(tǒng)［56］，使藥物在菌體內蓄積量減少，從而介導喹諾酮類藥物低水平耐藥；（3）質粒介導的耐藥機制。質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥（Plamidmediated quinolone resisitence，PMQR） 機 制 通 過PMQR基因實現(xiàn)。目前，qnr、Aac6’-Ib-cr、qepA和oqxA/B基因的作用機制已較為成熟，主要通過以下5種方式介導S.aureus產生耐藥：①與喹諾酮作用靶酶結合，降低藥物對細菌的抑制作用；②提高細菌MIC，增加細菌耐藥率；③促進細菌染色體基因自身突變，增加高水平耐藥菌株；④將藥物排出菌體外，降低藥物在菌體內的蓄積量；⑤使gyrA、parC功能區(qū)發(fā)生突變，細菌趨于高水平耐藥。而Cfr和fexA兩種基因在牛源S.aureu中報道較少，是今后挖掘S.aureus對喹諾酮類分子耐藥機制的新元素。

表2 S.aureus常見的基因突變位點［51-55］

3 結語

奶牛乳房炎S.aureus面臨著嚴峻的耐藥及其耐藥基因流行傳播形勢，出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象，但細菌耐藥性的產生是一種天然抗生現(xiàn)象，現(xiàn)代畜牧業(yè)中抗菌藥物的使用不可避免，隨著細菌耐藥性的快速發(fā)展，S.aureus耐藥機制日漸復雜。因此，應重點關注S.aureus耐藥現(xiàn)狀及其變遷情況，從分子水平深層探索S.aureus耐藥機制，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因，找出削減S.aureus及MRSA耐藥機理，避免抗菌藥物的惡循環(huán)濫用，為奶牛乳房炎設計合理的臨床治療方案。奶牛乳房炎源病菌耐藥性監(jiān)測試劑盒和相應新型抗菌藥物的研發(fā)是相關研究領域發(fā)展趨勢。