結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值及影響因素

夏青 桂淑玉 韓莙

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科（合肥230022）

我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，每年因結(jié)核病死亡病例達(dá)13萬例。結(jié)核病是一種慢性傳染病，其致病菌為結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌能夠侵犯機(jī)體的多個(gè)臟器，最常見的是肺結(jié)核，這些疾病都會(huì)對(duì)人體造成極大的危害。結(jié)核分枝桿菌感染后的臨床癥狀相當(dāng)復(fù)雜，特別是肺外結(jié)核感染，其臨床表現(xiàn)較為隱匿，癥狀不典型，常常容易導(dǎo)致誤診、漏診。因此，如何能夠快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，有效的控制結(jié)核病的繼續(xù)蔓延，已經(jīng)成為公共衛(wèi)生需要重視的問題?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于結(jié)核病的診斷多是在臨床癥狀的基礎(chǔ)上，結(jié)合結(jié)核菌培養(yǎng)、抗酸桿菌涂片、X線檢查、結(jié)核菌素試驗(yàn)及血清TB-Ab結(jié)果進(jìn)行確診。但因所需時(shí)間長(zhǎng)、敏感度低、假陽(yáng)性高、假陰性高等問題，不能及時(shí)、有效的診斷結(jié)核病，耽誤患者病情。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞［1］再次被暴露的抗原刺激，會(huì)在體外釋放γ干擾素?；谶@一研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)外學(xué)者提出T-SPOT.TB檢測(cè)法，利用結(jié)核特異抗原ESAT-6及CFP-10，通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)ELISPOT檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌。該檢測(cè)手段具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但T-SPOT.TB仍存在一定的假陽(yáng)性率和假陰性率，很少有報(bào)告探討T-SPOT.TB的影響因素。本研究通過對(duì)我院疑似結(jié)核病患者325例進(jìn)行T-SPOT.TB、PPD和血清TB-Ab檢查，分別研究其對(duì)結(jié)核病診斷的敏感度、特異性、假陽(yáng)性率和假陰性率，探討其在結(jié)核病診斷中的價(jià)值，并研究患者性別、年齡及血液中各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)T-SPOT.TB的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院2015年1月至2017年5月住院期間的疑似結(jié)核病患者325例，其中男224例，女101例，年齡8～95歲，平均（50.11±19.83）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：有咳嗽、咳痰、午后低熱或咯血等癥狀，胸部X線或相應(yīng)部位影像學(xué)檢查異常，排除AIDS感染、急性病毒感染、應(yīng)用免疫抑制劑、妊娠等免疫功能影響患者。按照最終確診結(jié)果分為結(jié)核性疾病組和非結(jié)核性疾病組。其中，結(jié)核性疾病組254例，非結(jié)核性疾病組71例。結(jié)核性疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)（滿足任意一項(xiàng)）：（1）涂片抗酸桿菌或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；（2）病理活檢提示結(jié)核；（3）臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)符合典型結(jié)核性改變，且抗結(jié)核治療有效。非結(jié)核性疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)（滿足任意一項(xiàng)）：（1）病理檢查明確腫瘤并排除結(jié)核分枝桿菌感染；（2）病理檢查確定為其他病原體感染；（3）抗結(jié)核治療無效，經(jīng)其他非抗結(jié)核治療有效。

1.2 儀器和試劑HealForce培養(yǎng)箱、T-SPOT.TB試劑盒采購(gòu)于英國(guó)Oxford Immunote Ltd公司；酶聯(lián)免疫熒光斑點(diǎn)分析儀采購(gòu)于德國(guó)AID公司；淋巴細(xì)胞分離液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液采購(gòu)于上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作程序

1.3.1 T-SPOT.TB結(jié)果判斷T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，抗原A和抗原B。（1）實(shí)驗(yàn)有效的標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)形成細(xì)胞計(jì)數(shù)＜10個(gè)，且陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)形成細(xì)胞計(jì)數(shù)＞20個(gè)。（2）陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：①陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為＜6個(gè)，且（抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)）-（陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）＞6個(gè)；②陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為＞6個(gè)，且（抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)）＞2倍（陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）。滿足陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)任意一條均為陽(yáng)性，否則為陰性［2］。

1.3.2 PPD結(jié)果判斷硬結(jié)平均直徑＜5 mm為陰性，直徑范圍5～9 mm為弱陽(yáng)性，10～19 mm為陽(yáng)性，≥20 mm或雖＜20 mm但局部出現(xiàn)水泡和淋巴管炎為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)［3］。

1.3.3 血清結(jié)核抗體檢測(cè)采用膠體金法，試劑由南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司提供。

1.3.4 NLR、PLR計(jì)算選擇患者入院時(shí)血常規(guī)、白蛋白檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算NLR、PLR。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用logistics回歸分析評(píng)估性別、年齡、血常規(guī)及白蛋白對(duì)T-SPOT.TB的影響，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果325例疑似結(jié)核病患者中，確診為活動(dòng)性結(jié)核病254例，包括肺結(jié)核（包括肺結(jié)核合并肺外結(jié)核）230例、肺外結(jié)核（包括結(jié)核性胸腔積液、骨結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、乳房結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核等）24例，非結(jié)核病患者71例（包括肺炎、支氣管擴(kuò)張、肺癌、塵肺、肺膿腫、間質(zhì)性肺炎等）。

2.2 各組患者T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果顯示，活動(dòng)性結(jié)核病254例患者，陽(yáng)性有200例，敏感度 78.74%（200/254），假陰性率21.26%（54/254）；非結(jié)核性疾病患者71例，陰性患者有54例，特異性76.06%（54/71），假陽(yáng)性率23.94%（17/71），見表1。

表1 各組患者T-SPOT.TB試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 T-SPOT.TB test results of patients in each group例（%）

2.3 各組患者PPD試驗(yàn)結(jié)果PPD診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為54.72%（139/254），特異性為71.83%（51/71），假陽(yáng)性率為28.17%（20/71），假陰性率為45.28%（115/254）。見表2。

2.4 各組患者血清TB-Ab試驗(yàn)結(jié)果血清TB-Ab診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度為40.94%（104/254），特異性為77.46%（55/71），假陽(yáng)性率為22.54%（16/71），假陰性率為59.06%（150/254）。見表3。

表2 不同類型患者PPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 PPD experimental results of different types of patients例（%）

表3 不同類型患者血清TB-Ab實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 SerumTB-Ab test results of different types of patients例（%）

2.5 對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病組、非結(jié)核病組分別進(jìn)行TSPOT.TB、PPD試驗(yàn)和血清TB-Ab三種方法檢測(cè)三種方法對(duì)結(jié)核病和非結(jié)核病的檢出差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 三種檢測(cè)方法分別在結(jié)核病組、非結(jié)核病組的比較Tab.4 Comparison of the three detection methods in the nontb group in the tuberculosis group

2.6 三種檢測(cè)方法在結(jié)核病診斷方面比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=90.00，P＜0.001），見表5。

表5 三種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病檢出率的比較Tab.5 Comparison of TB detection rates between the three detection methods

2.7 Logistics回歸分析性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白、白蛋白、PLR、NLR對(duì)T-SPOT.TB的影響?；貧w分析過程中，中性粒細(xì)胞和血小板未通過模型顯著性檢驗(yàn)。性別、年齡對(duì)T-SPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。白細(xì)胞對(duì)T-SPOT.TB系數(shù)為0.158，但白細(xì)胞對(duì)T-SPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。淋巴細(xì)胞與T-SPOT.TB呈正相關(guān)（r=10.53，P＜0.05）。血紅蛋白和白蛋白對(duì)TSPOT.TB無顯著性影響（P＞0.05）。NLR與T-SPOT.TB呈負(fù)相關(guān)（r=-2.146，P＜0.05），PLR與T-SPOT.TB呈負(fù)相關(guān)（r=-0.125，P＜ 0.05）（表6、7）。

3 討論

結(jié)核病仍然是本世紀(jì)嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病之一，具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、隱匿性強(qiáng)和臨床癥狀不典型等特點(diǎn)，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年約有900萬例新發(fā)的結(jié)核感染病例，特別是肺結(jié)核［4］?，F(xiàn)如今，世界衛(wèi)生組織把印度、中國(guó)、俄羅斯、南非、秘魯?shù)?2個(gè)國(guó)家列為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)、高危險(xiǎn)國(guó)家，全球80%的結(jié)核病例集中在這些國(guó)家，嚴(yán)重影響了這些國(guó)家人民的生存質(zhì)量。因此早期、快速準(zhǔn)確診斷結(jié)核病，是目前發(fā)展中國(guó)家防治結(jié)核發(fā)生的重要工作。

傳統(tǒng)意義上，進(jìn)行結(jié)核病原學(xué)［5］的檢查是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)。但病理學(xué)檢查對(duì)患者造成較大的創(chuàng)傷，臨床實(shí)施具有一定的困難，常規(guī)的結(jié)核菌培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)條件比較高，而且受到標(biāo)本質(zhì)量和結(jié)核菌數(shù)量的影響，假陰性率較高，痰涂片檢出率也相對(duì)較低。因此，在臨床診斷中，病原學(xué)檢查的方法并不普及。目前，臨床上多采用結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）［6］，結(jié)核菌素試驗(yàn)是一種臨床廣泛常用的結(jié)核篩查方法，向患者皮下注入結(jié)核菌素，通過主動(dòng)免疫，注射后48～72 h內(nèi)密切關(guān)注硬結(jié)大小，最后將硬結(jié)大小與不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，得出判斷結(jié)果。該方法具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，常作為診斷性抗結(jié)核治療的實(shí)驗(yàn)室檢查依據(jù)。但由于我國(guó)人群卡介苗接種率較高，存在PPD假陽(yáng)性率較高的情況，并且機(jī)體自身免疫狀態(tài)很容易影響PPD試驗(yàn)的結(jié)果，這一缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了該方法在臨床上的應(yīng)用。血清TB-Ab操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，常被臨床采用，但溶血樣本和高脂血樣本不宜，且易受免疫功能影響，疾病急性感染的早期，易出現(xiàn)陰性結(jié)果，假陰性率較高（本試驗(yàn)中，假陰性率達(dá)59.06%），敏感度低，臨床應(yīng)用價(jià)值有限。這些問題的存在，嚴(yán)重限制了結(jié)核病的準(zhǔn)確診斷和有效治療。

表6 各指標(biāo)對(duì)T-SPOT.TB的影響Tab.6 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

表7 各指標(biāo)對(duì)T-SPOT.TB的影響Tab.7 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

近年來，T-SPOT.TB試驗(yàn)憑借其在診斷結(jié)核分枝桿菌感染方面具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被逐漸推廣，用來診斷結(jié)核桿菌感染。自2006年該方法被相關(guān)部門認(rèn)證，越來越多的研究證明該方法的優(yōu)勢(shì)。T-SPOT.TB是由酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)［7］發(fā)展而來的檢測(cè)結(jié)核疾病的新型方法。T-SPOT.TB對(duì)T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)十分靈敏，其作用機(jī)理是通過檢測(cè)是否存在結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞后分泌的特異性細(xì)胞因子干擾素γ來明確患者有無結(jié)核感染。多項(xiàng)研究表明［8-11］，T-SPOT.TB對(duì)于診斷結(jié)核病的敏感度和特異性較高，同時(shí)T-SPOT.TB的敏感性不會(huì)受到機(jī)體免疫狀態(tài)的影響。隨著近些年對(duì)T-SPOT.TB的研究發(fā)現(xiàn)，該方法在檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病時(shí)，對(duì)機(jī)體狀態(tài)的影響小。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌被清除后，機(jī)體內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞就會(huì)立即消失，因此，T-SPOT.TB試驗(yàn)不僅適用于結(jié)核分枝桿菌感染患者，也能很好的反映患者的預(yù)后情況，還有利于胸腔積液內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞的檢測(cè)，能夠更加靈敏、準(zhǔn)確地反應(yīng)胸腔結(jié)核分枝桿菌感染的情況。本研究結(jié)果表示，對(duì)于鑒別結(jié)核病和非結(jié)核病，T-SPOT.TB、PPD試驗(yàn)和血清TB-Ab差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），同時(shí)，在比較T-SPOT.TB、PPD試驗(yàn)和血清TB-Ab對(duì)結(jié)核病的診斷效果時(shí)，本研究通過不同類型的結(jié)核病，比較各自的敏感度、假陽(yáng)性率、假陰性率等結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗酸桿菌涂片、結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢查等手段［12］確診的結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的敏感度（78.74%）明顯高于PPD試驗(yàn)、血清TB-Ab（P＜0.001），且特異性（76.06%）高。

但T-SPOT.TB仍存在假陽(yáng)性率23.94%、假陰性率21.26%。本研究中，男224例，女101例，年齡8～95歲，性別及年齡對(duì)T-SPOT.TB均無顯著性影響，血紅蛋白和白蛋白對(duì)T-SPOT.TB無顯著性影響。說明老年患者、貧血患者或者低蛋白血癥患者，雖免疫功能低下，對(duì)T-SPOT.TB結(jié)果影響較小。與以前的多項(xiàng)研究［13-14］一致。

結(jié)核病主要的免疫保護(hù)機(jī)制是細(xì)胞免疫，淋巴細(xì)胞是主要的免疫調(diào)控細(xì)胞。當(dāng)人體受結(jié)核分枝桿菌的感染，巨噬細(xì)胞立即作出反應(yīng)，大量分泌白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子使淋巴細(xì)胞聚集到結(jié)核分枝桿菌入侵部位，逐漸形成肉芽腫，限制并殺滅結(jié)核分枝桿菌。本研究中，淋巴細(xì)胞對(duì)T-SPOT有顯著性正向影響，淋巴細(xì)胞升高，易引起特異性免疫反應(yīng)。中性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用和吞噬能力，當(dāng)局部發(fā)生感染時(shí)，中性粒細(xì)胞可以快速穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入受侵部位，對(duì)感染的病原體發(fā)揮吞噬功能和清除作用，它可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活性［15］，血小板是凝血的重要因子，在免疫調(diào)節(jié)中作用顯著［16］，NLR、PLR作為炎癥標(biāo)志物，反映體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平，已被用于不同腫瘤疾病和炎癥疾病中的分期及預(yù)后影響因素［17-21］。本研究中，NLR、PLR對(duì)T-SPOT.TB均有顯著性負(fù)向影響。因此，對(duì)疑似結(jié)核病患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)時(shí)，尚需考慮此患者的淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、NLR及PLR對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。但本研究數(shù)據(jù)偏少，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量加以研究。

綜上所述，T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核病診斷有較高的敏感度和特異性，抽血24 h后便能得出診斷結(jié)果，準(zhǔn)確、快捷。但是該試驗(yàn)也存在一些技術(shù)和其他方面的問題。目前臨床上利用該方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的費(fèi)用比較昂貴，并且操作步驟比較繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)要求也比較高，受淋巴細(xì)胞、NLR、PLR的影響較大，需綜合分析其試驗(yàn)結(jié)果。但其在診斷結(jié)核感染方面有突出的優(yōu)勢(shì)，因此，臨床上有疑似結(jié)核感染的患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測(cè)，無疑可減少結(jié)核感染的漏診，也值得臨床應(yīng)用和推廣。