鹽酸卡替洛爾滴眼液中抑菌劑含量的測(cè)定方法研究

林文銘

0 引言

鹽酸卡替洛爾滴眼液在臨床上主要用于治療青光眼、高壓眼癥。該滴眼液處方中的抑菌劑苯扎氯銨，可以提高該制劑的穩(wěn)定性，防止因開啟使用過(guò)程中被微生物污染變質(zhì)而產(chǎn)生用藥安全隱患。雖然苯扎氯銨是有藥用標(biāo)準(zhǔn)的常用防腐劑，常用于眼用制劑[1](滴眼液中苯扎氯銨常用限量為0.003%～0.020%)，但其具有一定的毒性。有報(bào)道，即使在1/1 000的濃度下，經(jīng)?；蜷L(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)引起角膜功能障礙，破壞角膜屏障功能，引起變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎、視力減退等不良反應(yīng)。所以必須嚴(yán)格控制眼用制劑中防腐劑苯扎氯銨的含量。我國(guó)2015年版藥典中，鹽酸卡替洛爾滴眼液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)防腐劑含量的測(cè)定方法[2]，因此，有必要建立該制劑中防腐劑含量的測(cè)定方法，以評(píng)價(jià)其在保障一定的抑菌效力的情況下，用量采用最小有效濃度。這樣既能產(chǎn)生藥理作用，又不會(huì)對(duì)眼睛產(chǎn)生較大的刺激和損害。苯扎氯銨為氯化二甲基芐基烴銨的同系物組成的混合物(結(jié)構(gòu)式如圖1所示，R為烴基=C8H17～C18H37)，也稱為二甲基芐基烷基氯化銨，主要由十二烷基二甲基芐基氯化銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨和十六烷基二甲基芐基氯化銨3種同系物組成。根據(jù)苯扎氯銨對(duì)照品(1.11%，w/v)的標(biāo)簽說(shuō)明可以知道其主要同系物組分為苯扎氯銨C12同系物和苯扎氯銨C14同系物，比例依次為66.27%、33.33%。本研究對(duì)鹽酸卡替洛爾滴眼液中的苯扎氯銨進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其同系物組分為C12(R為烴基=C12H25)，因此，測(cè)定的苯扎氯銨含量以苯扎氯銨C12同系物(C21H38ClN) 為指標(biāo)表示。

圖1 苯扎氯銨分子結(jié)構(gòu)(R為烴基=C8H17～C18H37)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司) ；AB265-S型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；UV-1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 鹽酸卡替洛爾滴眼液(5 ml∶

100 mg)：中國(guó)大冢制藥有限公司(批號(hào)：1701012、1701022、1701032)；苯扎氯銨對(duì)照品(1.11%，w/v)：中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：100680-201607，規(guī)格：每1 ml 中含苯扎氯銨11.10 mg，其中含n-C12H25取代同系物為66.27%，n-C14H29取代同系物為33.33%)；鹽酸卡替洛爾原料藥：上海升德醫(yī)藥有限公司(批號(hào)：1609011)；醋酸銨、三乙胺、冰醋酸均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈為色譜純(德國(guó)Merck 公司)，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：YMC Triart C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：3 mmol/L醋酸銨水溶液(加1.5%三乙胺，用冰醋酸調(diào)pH至6.0±0.5)-乙腈=30∶70；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液 直接取用鹽酸卡替洛爾滴眼液制劑成品作為供試品溶液(含苯扎氯銨約為80 μg/ml)。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取苯扎氯銨對(duì)照品0.4 ml，置50 ml量瓶中，加蒸餾水稀釋定容，制得濃度為88.8 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液 取苯扎氯銨對(duì)照品溶液與供試品溶液1∶1混勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取“2.2”項(xiàng)中配制的對(duì)照品溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各20 μl，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，注入高效液相色譜儀檢測(cè)，記錄色譜圖，如圖2所示。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液中苯扎氯銨的保留時(shí)間分別為7.630 min(nC12H25)和13.690 min(nC14H29)；對(duì)比確定供試品溶液使用的為苯扎氯銨C12同系物；苯扎氯銨與主藥鹽酸卡替洛爾峰的分離度為19.3，苯扎氯銨(nC14H29)拖尾因子為1.317。結(jié)果表明，主藥及其他輔料和溶劑水均不干擾苯扎氯銨的檢測(cè)，各峰分離度符合要求，苯扎氯銨拖尾因子符合要求。專屬性、系統(tǒng)適用性良好。

圖2 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取苯扎氯銨對(duì)照品0.8 ml，置50 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度,定容搖勻作為儲(chǔ)備液。再分別精密量取該溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5 ml，分置于10 ml容量瓶中，加水稀釋定容至刻度,分別制得相當(dāng)于“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液(以n-C12H25取代同系物計(jì))含量的20%、40%、60%、80%、100%、120%、140%、150%的8組溶液。

分別精密量取該8組溶液各20 μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積值，如表1所示。以苯扎氯銨相對(duì)百分含量(C)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=65.54 C-0.916 7(r=0.999 9)。結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)濃度在對(duì)照品溶液標(biāo)示量的20%～150%的范圍內(nèi)，苯扎氯銨的含量和相應(yīng)峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μl，在給定的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄其峰面積值(以n-C12H25取代同系物計(jì))，如表2所示。結(jié)果顯示，苯扎氯銨色譜峰面積值的RSD為0.18%(n=6)，符合要求，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和儀器精密度良好。

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，進(jìn)行逐級(jí)定量稀釋，信噪比為3∶1時(shí)作為最低檢測(cè)限(以n-C12H25取代同系物計(jì))，此時(shí)苯扎氯銨的檢測(cè)限濃度為0.37 μg/ml；信噪比為10∶1時(shí)作為定量限，苯扎氯銨的定量限濃度為1.47 μg/ml。經(jīng)計(jì)算得本品的檢測(cè)限為7.4 ng，定量限為29.4 ng。由于供試品溶液中苯扎氯銨的濃度約為80 μg/ml，進(jìn)樣量約為1 600 ng，遠(yuǎn)高于檢測(cè)限，所以，本法的檢出限符合檢測(cè)要求。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取苯扎氯銨對(duì)照品0.2、0.4、0.6 ml，分別置于50 ml容量瓶中，加入含鹽酸卡替洛爾原料藥的空白溶液(不含苯扎氯銨)，稀釋定容至刻度，搖勻，分別制得相當(dāng)于對(duì)照品溶液含量的50%、100%、150%的3種不同濃度的樣品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定并記錄其峰面積，每種樣品溶液平行測(cè)定3次。將所得色譜峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算其相對(duì)百分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。苯扎氯銨在3種不同濃度溶液的平均回收率為99.9%，RSD為1.0%，均符合要求，方法準(zhǔn)確度良好。

表3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：1701012)，放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)依次進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得苯扎氯銨色譜峰面積值(以n-C12H25取代同系物計(jì))，如表4所示。計(jì)算得峰面積值的RSD為0.05%(n=7)，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)含量無(wú)明顯變化，穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 耐用性試驗(yàn) 分別在“2.1”項(xiàng)色譜標(biāo)準(zhǔn)條件下，僅分別改變柱溫為35 ℃、45 ℃(其他條件同“2.1”項(xiàng)下色譜條件)、僅分別改變流速為0.8、1.2 ml/min(其他條件同“2.1”項(xiàng)下色譜條件)的色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定苯扎氯銨對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)，并記錄其峰面積，計(jì)算供試品溶液中苯扎氯銨的相對(duì)含量(以n-C12H25取代同系物計(jì))，見(jiàn)表5。

表5 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，在上述色譜條件改變的情況下，苯扎氯銨峰與主藥峰的分離度均>1.5，苯扎氯銨峰的拖尾因子均<1.5，供試品溶液中苯扎氯銨含量變化的RSD為0.067%(<2.0%)。所以，檢測(cè)條件，包括柱溫和流速等微小的變化均不影響苯扎氯銨的含量檢測(cè)，苯扎氯銨峰與主藥鹽酸卡替洛爾峰的分離度和拖尾因子均符合要求，耐用性良好。

2.9 滴眼液中苯扎氯銨含量測(cè)定 精密量取3個(gè)批號(hào)(批號(hào)：1701012、1701022、1701032)的供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積值，每個(gè)批號(hào)的供試品溶液平行測(cè)定3份。將峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其相對(duì)含量，再計(jì)算含量平均值。結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，測(cè)定含量值均為對(duì)照品溶液標(biāo)示量的80.0%～120.0%范圍內(nèi)[2]，符合要求。

表6 含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本研究中，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，在參考了文獻(xiàn)[2-6]報(bào)道的有關(guān)苯扎氯銨檢測(cè)波長(zhǎng)的不同值后，再經(jīng)紫外分光光度法在200～280 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定苯扎氯銨在262 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，且有滿意的吸收值。因此，選擇262 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜柱、流動(dòng)相和柱溫的選擇 苯扎氯銨作為季銨鹽類化合物，色譜出峰易拖尾，峰形較差。參考文獻(xiàn)[2-6]后，通過(guò)條件摸索，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫的升高，峰形有所改善，但柱溫過(guò)高，對(duì)色譜柱的使用壽命影響較大，故采用羥基封端較好的色譜柱。通過(guò)流動(dòng)相的摸索，在柱溫40 ℃條件下，可將苯扎氯銨拖尾因子控制在1.3左右，優(yōu)于文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)，故將柱溫選為40 ℃。

3.3 方法優(yōu)點(diǎn) 我國(guó)2015年版藥典中鹽酸卡替洛爾滴眼液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)防腐劑含量的測(cè)定方法，有必要建立該制劑中防腐劑含量的測(cè)定方法。通過(guò)本文系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，本方法測(cè)定鹽酸卡替洛爾滴眼液中的防腐劑苯扎氯銨的含量，操作簡(jiǎn)便快速，精密度高，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于鹽酸卡替洛爾滴眼液中苯扎氯銨的限量控制。