血管腔內(nèi)成形術(shù)治療對糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC表達的影響

王明利，馮琦，賈一松，馬武勃，劉亞民

糖尿病足（DF）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，在世界范圍內(nèi)有著極高發(fā)病率[1]。糖尿病足患者的皮膚傷口愈合緩慢，嚴重者可能需要截肢，給患者健康造成嚴重威脅[2]。糖尿病可改變患者的血管生成，白細胞浸潤，巨噬細胞功能，細胞外基質(zhì)沉積和成纖維細胞轉(zhuǎn)化等生物學過程，對傷口愈合的各個階段（凝血，炎癥，再上皮化和重塑）都產(chǎn)生一定的影響[3,4]。盡管創(chuàng)面愈合的過程十分復雜，但是調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等多種生長因子，恢復血運重建是目前糖尿病足治療的重要手段[5,6]。

糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織愈合過程中，血管生成起著關(guān)鍵作用。多種信號通路被VEGF，血小板衍生生長因子，血管生成素，Notch，Wnt和轉(zhuǎn)化生長因子-β等細胞因子激活，其中又以VEGF作為主要參與者[7]。VEGF-A是血管生成的主要介質(zhì)，主要激活酪氨酸激酶受體VEGF受體-2（VEGFR-2）。而非受體酪氨酸激酶SRC（一種膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶）則是上述幾種生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導的重要下游，其轉(zhuǎn)導途徑包括磷脂酰肌醇-3-激酶，粘著斑激酶和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），對血管生成調(diào)控具有重要意義[8]。

經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)是已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于糖尿病足大血管重建的治療方法，但其對VEGF等血管生長因子的影響還不明確，為探究血管腔內(nèi)成形術(shù)對VEGF/VEGF-R2/SRC功能軸的影響，協(xié)助術(shù)后療效的預(yù)測和評估，我科自2015年1月～2017年12月采用經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)治療糖尿病足患者，觀察其療效，血管腔內(nèi)成形術(shù)治療對糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC表達的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組選擇2015年1月～2017年12月于寶雞市中醫(yī)醫(yī)院確診為糖尿病足的患者137例，其中男性69例，女性68例，年齡38～75（42.3±6.1）歲。所有患者依據(jù)WHO制定的診斷標準[9]確診為2型糖尿病，患者均以足部感染或潰瘍不愈為主要癥狀來院就診，并伴不同程度的足部皮膚麻涼、疼痛、間歇性跛行等癥狀，各類檢查證實患肢動脈有變形、狹窄或閉塞，血流速度減慢。本研究征得患者及其家屬同意，經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審批通過實施。將患者隨機分為手術(shù)組69例和對照組68例。手術(shù)組男性36例，女性33例；年齡43～74（53.1±11.2）歲；糖尿病病程3.4～22.6（16.8±3.9）年；糖尿病足病程23～248（52.6±15.3）d；Wagner分級：Ⅰ級23例，Ⅱ級22例，Ⅲ級18例，Ⅳ級6例；對照組男性34例，女性34例；年齡45～74（53.7±11.3）歲；糖尿病病程2.9～23.1（16.1±5.1）年；糖尿病足病程32～254（51.6±14.2）d；Wagner分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級20例，Ⅲ級19例，Ⅳ級8例。兩組患者一般資料比較無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法對照組患者嚴格執(zhí)行糖尿病飲食和胰島素降血糖、采集病變部位分泌物病原菌培養(yǎng)，根據(jù)藥敏結(jié)果選擇有效抗生素控制感染，局部清創(chuàng)及換藥等常規(guī)治療；手術(shù)組在對照組治療方法的基礎(chǔ)上，采取經(jīng)皮腔內(nèi)球囊擴張形成術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)的治療方法，局麻成功后，經(jīng)股動脈順行或脛后動脈逆行穿刺，成功后造影顯示病變動脈，注入肝素鈉3000 u，導絲穿過閉塞或狹窄動脈，以球囊進行擴張，若擴張后血管開通率＜70%，則置入金屬支架。膝關(guān)節(jié)以下病變動脈只采取球囊擴張，不進行支架置入治療。

1.2.2 創(chuàng)面愈合率測定患者于入組時、治療第2、4周，對足背創(chuàng)面拍照，測定創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。愈合率（%）=（1-目前創(chuàng)面面積/入組時創(chuàng)面面積）×100%。

1.2.3 患肢血管功能測定患者于入組時及治療第4周后，以彩色多普勒超聲診斷儀檢測治療前后內(nèi)膜中層厚度、收縮期血管峰值血流速度、靜息狀態(tài)下血管管徑（D0）、充盈狀態(tài)下血管管徑（D1），并計算彈性程度（D1-D0）/D0。

1.2.4 創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量測定兩組患者于治療4周后采用免疫組織化學染色檢測創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量，石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水、PBS洗涂（1 min×3次）、滴加VEGF/VEGF-R2/SRC（1:25）過夜，孵育，PBS清洗等操作均按照試劑盒說明書進行。鏡下棕黃色和棕褐色顆粒即為陽性細胞。采用Image-Pro Plus 5.0進行測量，分析圖中累計光密度值（IOD）。

1.2.5 創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達采用Real-time PCR檢測，于治療4周后提取兩組患者創(chuàng)面肉芽組織細胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行Real-time PCR監(jiān)測，嚴格按試劑盒說明進行操作。引物序列VEGF: 上游5’-ATG AACTTTCTGCTGTCTTGGGT-3’，下游5’-AT CATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3’；VEGFR-2: 上游5’-TACACGCAGTTGCAGTACATCG-3’，下游5’-CGCAGGATCTGGTAGAGGAAGT-3’；Src：上游5’-GAGCGGCTCCAGATTGTAA-3’，下游5’-CTGGGGATGTAGCCTGTCTGT-3’；以GAPDH為內(nèi)參，引物序列：5’-CAATGACCCCT TCATTGACC-3’，5’-TGGAAGATGGTGATGG GATT-3’。反應(yīng)條件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，40個PCR循環(huán)；繪制熔解曲線。以2-△△CT值法進行相對定量分析，以目的基因初始模板相對量與GAPDH初始模板相對量的比值表示VEGF、VEGF-R2、SRC的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者創(chuàng)面愈合率比較與對照組相比，手術(shù)組治療后第2、4周時創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組患者治療前后下肢血管功能比較手術(shù)組與對照組患者治療前內(nèi)膜中層厚度、收縮期血管峰值血流速度、（D1-D0）/D0等指標無明顯差異（P＞0.05）。治療后兩組患肢血管功能均較治療前明顯改善（P＜0.05），手術(shù)組較對照組療效更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。

表1 兩組患者創(chuàng)面愈合率比較

表2 兩組患者治療前后下肢血管功能比較（x±s）

2.3 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量比較治療4周后手術(shù)組創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量（IOD值）較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量比較

2.4 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達比較治療4周后手術(shù)組創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC表達較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2），基因表達結(jié)果與免疫組化相一致。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SRC基因表達與VEGF-R2表達正相關(guān)（r=0.541，P＜0.05）。

圖2 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達對比

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最隱匿，它影響著超過50%的糖尿病患者。糖尿病足在糖尿病患者中的發(fā)病率約為10%，糖尿病血管病變包括動脈炎和小血管血栓形成；缺血引起的神經(jīng)病變和大血管動脈粥樣硬化，三者疊加極易造成承重部位受累，引發(fā)糖尿病足潰瘍[10]。改善患足局部缺血對于促進糖尿病足潰瘍恢復具有重要意義，經(jīng)皮腔內(nèi)球囊擴張形成術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)是常用的改善下肢動脈血運的血管性介入治療手段。本研究發(fā)現(xiàn)，血管腔內(nèi)成形術(shù)治療較對照組患者創(chuàng)面愈合率明顯提高，下肢血運功能明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明血管腔內(nèi)成形術(shù)對于促進創(chuàng)面組織愈合，擴張血管，改善局部血液循環(huán)有重要意義。

糖尿病足具有慢性創(chuàng)傷的所有特征，傷口愈合是一個復雜，動態(tài)和有序的控制過程，其中血管生成或新血管形成通過滋養(yǎng)新形成的組織來起到關(guān)鍵的病理生理學作用[11]。傷口愈合過程始于炎癥反應(yīng)，然后是新的組織和肉芽生成，募集和血管生成的內(nèi)皮細胞生長。 PDGF，VEGF及其受體和TGF-β在這些過程中起關(guān)鍵作用，其中VEGF是血管生成的關(guān)鍵刺激因子，可誘導血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂和遷移，并且其受體具有酪氨酸激酶活性，直接調(diào)控內(nèi)皮細胞膜中的Ca2+通道開放[12]。有證據(jù)表明，糖尿病患者組織中VEGF的濃度降低，而VEGF在激活和指導傷口愈合的各個階段都是不可或缺的，具體而言，VEGF可誘導生產(chǎn)性細胞向受傷區(qū)域遷移；引導細胞外基質(zhì)積聚，促進起始血管的生成和成熟，刺激肉芽組織生長；還可促進成纖維細胞活化和增殖，刺激傷口收縮[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面肉芽組織VEGF含量在腔內(nèi)血管成形術(shù)后顯著提高，明顯高于對照組。說明血管腔內(nèi)成形術(shù)可以有效的恢復創(chuàng)面VEGF表達，改善傷口愈合的各階段的VEGF不足，這可能是術(shù)后創(chuàng)面愈合速率較快的機制之一。

VEGF通過結(jié)合跨膜受體（如VEGFR1和VEGFR2）發(fā)揮其生物學功能，兩者都在內(nèi)皮細胞表面特異性表達，并含有胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。VEGF通過與其兩種受體酪氨酸激酶VEGF-R1和VEGF-R2在血管內(nèi)皮細胞上相結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控血管生成的作用[14]。目前的研究表明，VEGF-R2似乎介導大多數(shù)已知的對VEGF-A的細胞應(yīng)答，在腫瘤血管生成過程中，VEGF介導的血管生成作用可能是SRC依賴的[15]。因此我們研究了血管腔內(nèi)成形術(shù)對SRC的影響，結(jié)果表明SRC在血管腔內(nèi)成形術(shù)后的表達亦明顯增加，而其對血管生成的具體機制還需進一步研究，SRC的調(diào)控作用可能與MAPK信號通路有關(guān)，在SRC作用下Ras/Raf/MEK/ERK信號通路激活可能是術(shù)后肉芽組織愈合加快的重要原因[16]。另外，VEGF-R2與SRC的表達正相關(guān)，作為VEGF的下游信號分子，VEGF-R2與SRC在對血管腔內(nèi)成形術(shù)的療效評價方面可能有其獨特的意義，但具體相關(guān)性有待大樣本多中心數(shù)據(jù)進一步證實。

綜上所述，經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)治療可有效的促進糖尿病足患者創(chuàng)面愈合，改善患肢血運功能。而其對創(chuàng)面愈合的促進作用可能是因為創(chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC軸的表達增加。術(shù)后VEGF及其下游VEGF-R2/SRC在創(chuàng)面肉芽組織乃至血清中的表達變化檢測，可能為糖尿病足患者經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)的療效評估以及預(yù)后分析提供依據(jù)。