和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用及其機制研究

朱為勇，唐元升，蓋延紅，李越凡，尹剛

動脈粥樣硬化（AS）是冠狀動脈硬化性心臟病、高血壓等多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)，是由斑塊積聚引起的常見動脈病癥。血管內(nèi)皮下層氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的沉積是AS的特征之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在AS的發(fā)生發(fā)展中起到重要促進作用，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是AS的始動發(fā)病機制[2,3]。 而大量文獻報道ox-LDL是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因子之一；ox-LDL可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[4-7]。和厚樸酚是傳統(tǒng)中藥厚樸中分離出的有效成分之一，是一種含有酚羥基的活性物質(zhì)，具有一定的心血管保護作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤，抗炎和抗氧化活性[9]。但截至目前，仍不明確和厚樸酚是否具有保護ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。本研究通過ox-LDL來誘導(dǎo)HUVECs損傷，探討和厚樸酚對ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用及可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象及主要試劑人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購于上海豐壽生物科技有限公司（源自ATCC庫）；RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、1%青鏈霉素、胎牛血清購于美國GIBCO公司；和厚樸酚對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度＞98%；ox-LDL購于北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK8）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；兔源或鼠源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、活化的半胱天冬酶半胱天冬酶-3（Cleaved Caspase3）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、p-PERK、真核起始因子2α （elF2α）、p-elF2α多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；兔源或鼠源轉(zhuǎn)錄激活因子、C/EBP同源蛋白和GAPDH多克隆抗體來自于英國Abcam公司；Western blotting相關(guān)試劑、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗購于碧云天研究所；ROS檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒和谷胱甘肽（GSH）測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱；TriStar2 LB 942型多功能酶標(biāo)儀；高速離心機；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司，DHG-9140A） ；倒置熒光顯微鏡；Mini-Protean tetra型垂直板電泳裝置；低溫離心機；凝膠成像儀（BIO-RAD）；Epics-XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理HUVECs在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。2～3 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合至90%左右時常規(guī)傳代。配置100 ng/L的ox-LDL的溶液并無菌處理，細(xì)胞干預(yù)前均做同步化處理。和厚樸酚溶解于10 μm的DMSO中，并以0.22 μm濾膜過濾，置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 實驗分組檢測細(xì)胞增殖時，在培養(yǎng)基中加入0.1、1、10、50、100 μmol/L濃度的和厚樸酚，分別干預(yù)24 h和48 h，不加藥為對照組。其余實驗分為Blank組、ox-LDL組；在ox-LDL干預(yù)細(xì)胞時，分別在培養(yǎng)基中加入0.1、1、10 μmol/L的和厚樸酚，設(shè)置ox-LDL+0.1 μmol/L、ox-LDL+1 μmol/L和ox-LDL+10 μmol/L組。

1.3.3 細(xì)胞增殖-毒性檢測CCK8法測細(xì)胞增殖取生長狀態(tài)良好的HUVECs，每孔5000個種于96孔板中，待細(xì)胞融合生長至80%后，加入不同濃度的和厚樸酚（0.1、1、10、50、100 μmol/L）。分別干預(yù)24 h、48 h后，每孔加入CCK8工作液10 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀于570 nm 處測定每個孔A570 值。檢測和厚樸酚對ox-LDL處理的HUVECs的影響時，在不同濃度的和厚樸酚中加入100 mg/L的ox-LDL干預(yù)細(xì)胞24 h，隨后按照上述辦法檢測細(xì)胞增殖。CCK8細(xì)胞增殖活率=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組），每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 氧化應(yīng)激水平和抗氧化酶水平檢測用無血清培養(yǎng)液稀釋試劑盒中的DCFH-DA探針（濃度為10 μmol/L）。細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞，離心后加入DCFH-DA，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。PBS洗滌2次后，收集沉淀用于熒光檢測。1 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm），最終熒光強度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。通過比色法測定細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的水平：收集上述分組的細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按試劑盒說明書方法，檢測細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA、CAT和GSH的水平。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡以1×105/孔細(xì)胞密度將HUVECs接種于6孔板，按照不同實驗分組和用藥方法處理細(xì)胞。作用24 h后，用0.25%的胰酶進行消化，隨后室溫下3000 rpm離心5 min收集細(xì)胞；用預(yù)冷PBS（4℃）重懸細(xì)胞，3000 rpm離心5 min，洗滌2次，加入300 μl的1×BindingBuffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后避光孵育15 min；上機前5 min再加入5 μl的碘化丙啶（PI）染色，并補加200 μl的1×Binding Buffer，最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期和晚期凋亡率。

1.3.6 免疫印跡法檢測蛋白表達量提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA法定量蛋白，蛋白變性后進行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，每孔加入30 μg的樣品，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm孔徑的PVDF上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后常溫下TBST洗膜3次，5%脫脂牛奶封閉1 h，孵育BCL-2、Bax、Cleaved Caspase3、p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4、CHOP和GAPDH（1:1000），4℃過夜。次日，常溫下TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（鼠）二抗（1:5000）孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像儀上拍照。蛋白表達強度以各條帶灰度值/GAPDH灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0和GraphPad Prism 5.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組之間比較用單因素方差分析和SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖能力的影響首先，我們檢測不同濃度和厚樸酚對HUVECs細(xì)胞干預(yù)的適宜濃度。表1結(jié)果表明，使用和厚樸酚干預(yù)24 h后，50 μmol/L的和厚樸酚對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用；類似的，干預(yù)48 h時，0.1～10 μmol/L的和厚樸酚對細(xì)胞增殖沒有明顯影響，而50 μmol/L和100 μmol/L的和厚樸酚對細(xì)胞增殖明顯抑制，表明高濃度和厚樸酚對HUVECs存在一定細(xì)胞毒性。因此，我們選擇0.1～10 μmol/L的和厚樸酚用于實驗。表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ox-LDL組細(xì)胞的增殖能力明顯下降；而與ox-LDL組相比，和厚樸酚成濃度依賴性增加細(xì)胞的增殖能力。以上結(jié)果提示，和厚樸酚可逆轉(zhuǎn)ox-LDL導(dǎo)致的HUVECs增殖抑制。

2.2 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激的影響Ox-LDL可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，檢測和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激水平的影響。與對照組比較，ox-LDL組ROS水平明顯增加，而和厚樸酚可呈濃度依賴性抑制ox-LDL誘導(dǎo)的ROS水平（P均＜0.05）（表3）。如表4所示，與對照組相比，ox-LDL組細(xì)胞MDA水平明顯增加，而SOD、CAT和GSH水平明顯下降（P均＜0.01）。加用0.1 μmol/L和厚樸酚后，雖然上述指標(biāo)有所改變，但與ox-LDL組比較無統(tǒng)計學(xué)意義；與ox-LDL組相比，加入1 μmol/L和10 μmol/L和厚樸酚后，MDA水平明顯下降，SOD、CAT和GSH水平明顯增加（P均＜0.05）。

2.3 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響Ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通常伴隨著細(xì)胞凋亡，因此我們探討不同濃度的和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，相比于對照組，ox-LDL組細(xì)胞凋亡比率明顯增加，而加用不同濃度的和厚樸酚后，細(xì)胞凋亡比率卡死逐漸降低，ox-LDL+10 μmol/L和厚樸酚組抑制凋亡最明顯（P＜0.05）。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，與ox-LDL明顯降低Bcl-2/Bax比率，增加Cleaved caspase3表達（P＜0.05）。相反，與ox-LDL組相比，和厚樸酚成濃度依賴性增加Bcl-2/Bax比率，降低Cleaved caspase3的表達（P＜0.05）（圖1）。

表1 和厚樸酚對HUVECs增殖的影響（x±s）

表2 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響（x±s）

表3 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs活性氧（ROS）水平的影響（x±s）

2.4 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）通路的改變?yōu)檫M一步分析和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞保護作用的機制，我們檢測ERS相關(guān)通路在其中的作用。如圖2所示，與對照組相比，ox-LDL處理明顯激活p-elF2α和p-PERK的表達（P＜0.05）；隨后，ox-LDL上調(diào)ATF4和CHOP的表達（P＜0.05）。而不同濃度的和厚樸酚處理，被ox-LDL激活的elF2α/PERK/ATF4/CHOP信號通路呈濃度依賴性受到抑制（P均＜0.05），提示CHOP信號通路在和厚樸酚對抗ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起重要作用。

表4 和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激相關(guān)分子水平的影響（x±s）

3 討論

近年來，大量研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能改變是AS 發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)，而血管壁內(nèi)沉積的ox-LDL是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子[10-12]。因此，抑制ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷有望成為預(yù)防或緩解AS進展的有效措施。Ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因之一[13]。另一方面，也有報道發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）引起細(xì)胞凋亡[14]。結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs增殖下降和凋亡水平增加，增加ROS水平和激活ERS下游eIF2α/PERK/ATF4/CHOP通路，進一步證實了ox-LDL可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和ERS引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

圖1 不同濃度和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響。（A）流式細(xì)胞儀檢測不同組細(xì)胞凋亡率；（B）定量分析比較各組凋亡水平；（C）Western blotting檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的改變；（D-E）定量分析比較各組凋亡相關(guān)蛋白的水平。與對照組比較，aP＜0.05；與ox-LDL組比較，bP＜0.05

圖2 不同濃度和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞ERS相關(guān)通路的影響。（A）Western blotting檢測不同濃度和厚樸酚對elF2α/PERK/ATF4/CHOP信號通路的影響；（B-C）各組之間p-elF2α/elF2α和p-PERK/PERK的比較分析；（D）各組織間ATF4和CHOP蛋白的比較分析。與對照組比較，aP＜0.05；與ox-LDL組比較，bP＜0.05

和厚樸酚來自木蘭科落葉喬木植物厚樸的樹皮，是厚樸的最主要的兩個活性組分之一。和厚樸酚具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和心血管保護作用。本研究首先研究不同濃度的和厚樸酚對正常內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)高濃度的和厚樸酚對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，提示高濃度和厚樸酚具有一定毒性。為探討和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用，本研究使用不同濃度的和厚樸酚對ox-LDL處理的HUVECs進行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，和厚樸酚呈濃度依賴性促進HUVECs增殖，抑制凋亡。而且和厚樸酚可以緩解ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提示和厚樸酚可能通過抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起到內(nèi)皮保護作用。先前的研究表明，和厚樸酚可減少棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的合成，改善內(nèi)皮功能紊亂[15]。動物實驗表明和厚樸酚可抑制新生內(nèi)膜的形成，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[16]。我們首次發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可保護ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。機制層面，以往研究表明和厚樸酚可通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激改善心肌缺血再灌注損傷[17]。類似的，和厚樸酚可通過抑制NADPH依賴的氧化應(yīng)激通路，減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞紊亂[18]。本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚同樣能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少ROS產(chǎn)生，增加抗氧化酶水平。已有研究證實PERK/eIF2α/CHOP通路參與ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[19]，而有研究者發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可通過抑制ERS改善小鼠認(rèn)知功能[20]，表明和厚樸酚具有抑制ERS的作用。我們首次發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可通過抑制PERK/eIF2α/CHOP通路，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的ERS，抑制細(xì)胞凋亡。因此，我們有理由相信和厚樸酚可通過抑制氧化應(yīng)激和ERS保護內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，低濃度（0.1、1、10 μmol/L）的和厚樸酚對HUVECs 細(xì)胞無毒性作用而高濃度（50、100 μmol/L）和厚樸酚具有一定的細(xì)胞毒性；和厚樸酚對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護作用，其機制可能是通過抑制氧化應(yīng)激和ERS，從而起到抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。該研究結(jié)果將會為和厚樸酚在AS相關(guān)疾病如冠心病的開發(fā)應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。但ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與ERS之間的關(guān)系，以及ERS其他通路在和厚樸酚保護內(nèi)皮細(xì)胞中的作用尚不明確，有待于在今后的研究中進一步闡述。