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    萊菔硫烷對過氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及機制研究

    2018-11-07 11:33:26康小榮張明升秦綱
    關(guān)鍵詞:萊菔內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激

    康小榮,張明升,秦綱

    萊菔硫烷作為異硫氰酸鹽類化合物,因具有抗氧化、抑制腫瘤、心血管保護等治療作用,再加上蔬菜西蘭花中含量豐富,近年來成為國內(nèi)外研究熱點。研究顯示,萊菔硫烷本身并不直接參與抗氧化反應(yīng),它與谷胱甘肽和蛋白巰基反應(yīng),通過間接途徑激活Nrf2,誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列二相酶和抗氧化酶實現(xiàn)抗氧化作用[1]。因此萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞可能也有保護作用,但相關(guān)報道尚不多見。本實驗以H2O2干預(yù)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)建立氧化應(yīng)激模型,旨在明確萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞是否具有保護作用,并進一步探討其可能機制,為探討萊菔硫烷的心血管保護作用提供理論及實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑實驗對象來源于人臍靜脈血內(nèi)皮細胞株HUVEC(中科院細胞庫)。胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)。含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)粉、PBS粉(北京索萊寶生物科技公司)。萊菔硫烷、過氧化氫(美國sigma公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)。ROS檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。YBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems)。TRIzol試劑(ambion)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)。DNaseⅠ(Fermentas)。SMATB全自動酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)。流式細胞儀(BECKMAN公司)。熒光定量PCR儀(Real-Time System)。PCR 儀(T100-Thermal Cycler)。水平電泳設(shè)備(DYC-31D)。凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)。

    1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組復(fù)蘇凍存的HUVEC,培養(yǎng)液是含10%的胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞至80%融合度時,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。實驗分組:①空白對照組(對照組):細胞正常培養(yǎng)2.5 h;②過氧化氫組(H2O2組):分別給予100、200、400、600、800 μmol/L濃度培養(yǎng)細胞2 h,選擇400 μmol/L為其最佳干預(yù)濃度(后續(xù)各組如未特殊注明,默認(rèn)H2O2濃度為400 μmol/L);③萊菔硫烷+過氧化氫組(SFN+H2O2組):不同濃度SFN(2.5、5、10 μmol/L)預(yù)孵育30 min后,加入400 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

    1.3 MTT法測定HUVEC細胞活性HUVEC按4×103/ml密度接種到96孔板,每孔200 μl。待細胞生長融合達80%后,分別依照實驗分組干預(yù)2.5 h,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/m1),繼續(xù)孵育4 h,小心吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入DMSO(二甲基亞砜)150 μl,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。使用全自動酶標(biāo)儀,測定并記錄各孔在波長為570 nm處的吸光光度值(A值),設(shè)對照組HUVEC的細胞活性為100%,實驗組A值/對照組A值表示其活性。

    1.4 流式細胞儀測定細胞內(nèi)ROS水平細胞按1×105個/ml密度接種于6孔板,每孔1 ml。收集各組細胞,去除培養(yǎng)基,細胞收集后懸浮于濃度為10 μmol/L的DCFH-DA探針中,使細胞濃度為 1×107/ml,繼續(xù)孵育20 min,每隔3~5 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。然后用無血清培養(yǎng)基洗滌3次,流式細胞儀測定并記錄各樣本的ROS相對水平。

    1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR法)測定Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平細胞按2×105個/ml密度接種于6個小培養(yǎng)皿,每孔2 ml。收集各組細胞,用TRIzol提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA并擴增目的基因,設(shè)β-actin為內(nèi)參照。Nrf2引物序列為5'-GGTAAGAATAAAGTGGCT-3'和5'-TTGTTTTTTCAGTAGGTG-3';HO-l引物序列為5'—TTCAGAAGGGTCAGGTGT-3'和5'-AGTAGAGTGGGGCATAGA-3';β—actin引物序列為5'-CCACTCCTCCACCTTTG-3'和5'-CACCACCCTGTTGCTGT-3'。各引物序列用Qbase plus軟件設(shè)計。總RNA(500 ng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,建立20 μl反應(yīng)體系,42℃孵育60 min,70℃孵育15 min,16℃,保持;反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆?。將制備好的cDNA進行PCR擴增,建立20 μl反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為:95℃,3 min預(yù)變性;95℃,5 sec變性;56℃,10 sec退火;72℃,25 sec延伸;39 個循環(huán);65℃,5Sec;95℃,50 Sec。擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳,用Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)成像,記錄并用△△Ct法計算Nrf2、HO-1基因的相對表達量。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用(±s)表示。經(jīng)正態(tài)分布檢驗、方差齊性檢驗后,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 H2O2作用于HUVEC細胞后細胞存活率下降,SFN預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)H2O2對HUVEC細胞存活率的影響H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的細胞活性依次為對照組的96.5%、84.4%、61.4%、58.0%和54.4%(P<0.05),選擇400 μmol/L為其有效干預(yù)濃度(后續(xù)各組如未特殊注明,默認(rèn)H2O2濃度為400 μmol/L)。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L單獨作用后各組細胞活性依次為對照組的98.2%、93.1%、89.0%(P<0.05)。SFN 2.5、5、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2,各組細胞活性依次為對照組的69.4%、82.9%、86.9%(與H2O2組比較,P<0.05)(圖1)。

    2.2 SFN預(yù)處理后減少H2O2所致HUVEC細胞內(nèi)ROS生成H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的ROS水平依次為對照組的為1.25、3.45、6.71、6.78、6.78(P<0.05)。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2,各組細胞ROS水平依次為H2O2組的0.82、0.74、0.50(P<0.05)(圖2)。

    2.3 SFN預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)H2O2所致HUVEC細胞Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的Nrf2 mRNA水平依次為對照組的0.86、0.40、0.32、0.14、0.05(P<0.05),HO-1 mRNA水平依次為對照組的為0.92、0.40、0.27、0.17、0.09(P<0.05)。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2,各組細胞Nrf2 mRNA水平依次為H2O2組的1.10、1.39、2.05(P<0.05),HO-1 mRNA水平依次為H2O2組的1.58、1.74、1.97(P<0.05)(圖3)。

    圖1 MTT法檢測各組細胞活性的結(jié)果

    圖2 流式細胞儀檢測各組細胞ROS相對水平

    圖3 RT-PCR法檢測各組細胞Nr f2 mRNA、HO-1mRN相對水平的結(jié)果

    3 討論

    流行病學(xué)研究表明,萊菔硫烷攝入量與心血管疾病風(fēng)險降低有關(guān)[2]。實驗觀察到SFN可以降低自發(fā)性高血壓性卒中大鼠腦動脈的氧化應(yīng)激和炎癥[3]。在健康志愿者的實驗中,血漿中的SFN可以被迅速消除,但它誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生使得血管生理效應(yīng)可以延長到24 h[4]。動物和人體實驗都證實了SFN對心血管疾病的保護作用,包括高血壓、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等[5]。本研究從體外培養(yǎng)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞,建立內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激模型,探討萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞是否也有保護效應(yīng)。

    血管內(nèi)皮細胞合成并釋放多種生物活性分子,調(diào)節(jié)血管擴張與收縮、溶解血栓,維持血管壁內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。血管內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低和心血管疾病的發(fā)生,是動脈粥樣硬化發(fā)病的第一步[6]。內(nèi)皮功能障礙與常見疾病的發(fā)病機制密切相關(guān),氧化應(yīng)激、缺氧和血流紊亂是與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的重要因素[7]。

    H2O2作為一種機體產(chǎn)生的活性氧(ROS),低濃度時可作為信號分子調(diào)節(jié)基因表達和信號傳導(dǎo),高濃度的H2O2則會引起氧化應(yīng)激[8]。以H2O2干預(yù)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞(HUVEC)建立氧化應(yīng)激模型[9],通過MTT法和流式細胞儀分別檢測HUVEC中的細胞活性和ROS表達水平。實驗結(jié)果顯示:隨著過氧化氫濃度升高,細胞活性逐步降低,ROS表達水平逐漸升高,這表明H2O2濃度依賴性地?fù)p傷內(nèi)皮細胞,并且證明氧化應(yīng)激是損傷內(nèi)皮細胞的可能機制之一。SFN預(yù)處理細胞后,隨著SFN濃度升高,被H2O2抑制的細胞活性升高,ROS表達水平降低,這提示萊菔硫烷可以對抗內(nèi)皮細胞損傷,這種作用可能與其抗氧化和抗炎作用有關(guān),而且SFN的這種保護作用呈濃度依賴性。

    生理條件下機體抗氧化防御機制包括多種活性氧清除酶、Ⅱ相解毒酶及其他抗氧化劑,每種抗氧化劑在其啟動子區(qū)域都有細胞核結(jié)合抗氧化元件(ARE)。Nrf2作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控多種ARE途徑控制一系列下游靶基因,包括血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶-1(NQO1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和硫氧還蛋白(TRX),在ROS損傷細胞過程起著重要作用[10],起到減少細胞凋亡,延緩衰老和減少器官損傷等多方面的作用[11]。小鼠實驗證明,Nrf2表達增加使得Ⅱ相解毒酶活性增強,間接保護氧化低密度脂蛋白介導(dǎo)的巨噬細胞損傷,而Nrf2表達減少增加泡沫細胞形成和促進動脈粥樣硬化[12]。同時還有研究表明,Nrf2的下游靶基因HO-1通過降低氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)單核細胞再生抑制動脈粥樣硬化形成,在抗動脈粥樣硬化過程起著至關(guān)重要的作用[13]。

    本實驗以RT-PCR法檢測HUVEC中的Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平。低水平的氧化應(yīng)激會激活細胞自身抗氧化機制,刺激Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平增高,對內(nèi)皮細胞有保護作用。實驗結(jié)果顯示,高濃度H2O2作用于細胞后,Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平顯著降低,提示高濃度H2O2對細胞整體的損傷作用超過了其自身保護機制。在使用SFN預(yù)處理后,較H2O2損傷的細胞,細胞活性升高,ROS水平下降,Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平明顯提高,且呈明顯濃度依賴性,提示SFN可以通過激活Nrf2/HO-1途徑增強細胞抗氧化損傷的作用。

    綜上所述,本實驗初步探討了SFN對H2O2致HUVEC損傷的保護作用,提示一定范圍內(nèi)SFN對內(nèi)皮細胞的抗氧化損傷作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),SFN在轉(zhuǎn)錄水平激活Nrf2/HO-1途徑在這一過程中起到了關(guān)鍵作用,為利用SFN對心血管疾病進行治療提供了基礎(chǔ)實驗和理論依據(jù)。但Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達水平如何以及SFN是否還通過其他途徑對抗細胞損傷,還需要進一步探討。

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