GM-CSF和FliC作為新型復合生物佐劑對豬圓環(huán)病毒疫苗的免疫增強效果

任桂萍，張 騰，吳 超，李德山

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

豬圓環(huán)病毒是斷奶仔豬和保育豬常見疾病，發(fā)病率可達50%，死亡率因豬場條件、繼發(fā)感染情況而異，一般在5%～70%[1]。PCV-2疫苗可有效改善豬圓環(huán)病毒感染情況[2]。

目前國內(nèi)外防治豬圓環(huán)病毒方法主要為疫苗注射，但免疫效果不明顯，疫苗佐劑添加尤為重要[3]。鋁鹽佐劑最早應用于疫苗免疫，抗原吸附強度決定免疫效果，對機體有副作用、無法刺激細胞免疫[4]；乳劑類佐劑包括弗氏不完全佐劑（IFA）、弗氏完全佐劑（CFA）[5-6]，易造成局部炎癥，注射部位形成肉芽腫及持續(xù)性潰爛，僅用于科研試驗；此外還包括天然佐劑，但應用受限[7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)肽聚糖、脂多糖及霍亂毒素等微生物來源佐劑具有良好佐劑活性[8]，細胞因子如干擾素、白細胞介素（IL）-1等免疫調(diào)節(jié)作用較強。

目前復合生物佐劑研究較少，施建東等研究復合佐劑對狂犬疫苗和乙肝疫苗的免疫增強效果[9-10]。本文選擇巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF和細菌鞭毛蛋白FliC作為復合生物佐劑，研究其對豬圓環(huán)病毒疫苗的免疫增強效果。

活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞等多種細胞產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF[11-12]，具有多種生物學活性，可誘導造血細胞增殖和分化，維持粒細胞系存活[13]；增強中性粒細胞和巨噬細胞吞噬與殺傷功能及嗜酸性粒細胞殺傷活性[14]。GM-CSF作為細胞因子，微量高效、作用迅速，與激素效果相似，又稱免疫激素[15]。細菌鞭毛蛋白FliC可結(jié)合TLR家族受體[16]配體激活機體免疫應答。鞭毛為鼠傷寒沙門氏菌[17]一部分，細菌鞭毛蛋白作為特殊的炎性刺激分子，為TLR5和NLRC4配體，胞外鞭毛蛋白由TLR5識別，鞭毛細菌在胞內(nèi)感染時，由IPAF和Naip5直接識別[18-19]。FliC可作為免疫佐劑，產(chǎn)生一系列傳遞信號，激活T淋巴細胞，調(diào)動免疫系統(tǒng)，使機體對抗原刺激產(chǎn)生反應，實現(xiàn)免疫佐劑作用[20-21]。細菌鞭毛蛋白作為最具潛力的候選疫苗佐劑，可誘導產(chǎn)生黏膜IgA，防止黏膜表面局部病原感染[22]。結(jié)合納米粒子的細菌鞭毛蛋白佐劑可誘導更廣泛的細胞因子譜[23]。

細胞巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF可參與多種應答反應，細菌鞭毛蛋白FliC可刺激天然免疫應答，二者具有微量高效等特點，本試驗選擇GM-CSF和FliC作為研究對象，探究復合生物佐劑增強豬圓環(huán)疫苗免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌

SUMO-GM-CSF和SUMO-FliC工程菌，由東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物制藥教研室保存。

1.1.2 試驗動物

BALB/c小鼠，6周齡雌性，購自長春市億斯實驗動物有限公司。

1.1.3 生化試劑

IPTG、溶菌酶、氨芐青霉素（購自TaKaRa公司）；親和層析柱HisTrapTM FF crude colum購自GE公司；SUMO Protease-I（由本實驗室純化獲得）；蛋白Marker購自Fermenta公司。

1.1.4 疫苗

哈藥豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（滅活前每毫升含豬圓環(huán)病毒2型LG株不低于105.5TCID50）

1.2 方法

1.2.1 GM-CSF蛋白優(yōu)化表達及制備

1.2.1.1 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導劑濃度確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于4個氨芐抗性液體培養(yǎng)基。接種后置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時，分別加入終濃度為1、0.75、0.5、0.25 mmol·L-1IPTG，37℃誘導培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，分別制備未誘導組，誘導后上清、沉淀蛋白樣品，通過15%SDS-PAGE電泳分析，在相同誘導溫度、時間，比較不同IPTG終濃度時SUMOGM-CSF蛋白表達量差異。

1.2.1.2 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導溫度確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于3個氨芐抗性液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時，加入IPTG，分別37、25、16℃誘導培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，制備未誘導組，誘導后上清，誘導后沉淀蛋白樣品，通過15%SDSPAGE電泳分析，在相同IPTG終濃度、誘導時間，比較不同誘導溫度時SUMO-GM-CSF蛋白表達量差異。

1.2.1.3 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導時間確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于3個氨芐抗性液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時，加入IPTG，分別誘導2、4和6 h，培養(yǎng)結(jié)束后，制備未誘導組，誘導后上清，誘導后沉淀蛋白樣品，通過15%SDS-PAGE電泳分析，在相同誘導溫度、IPTG終濃度，比較不同誘導時間SUMO-GM-CSF蛋白表達量差異。

1.2.1.4 SUMO-GM-CSF融合蛋白變性及復性

經(jīng)大瓶培養(yǎng)的SUMO-GM-CSF菌液，離心棄上清，沉淀物用PBS（pH 7.4）溶液懸起，按照0.001 g·mL-1加入溶菌酶。冰上放置1 h后超聲破碎，每次超聲波破碎10 s，重復3～5次，直至菌液無粘稠物。破碎后收集破碎沉淀，PBS溶液洗滌沉淀，重復2次。洗滌后，用含有8 mol·L-1尿素變性液溶解沉淀，4℃冰箱中放置12 h后，10 000 r·min-1，4℃離心30 min，吸取上清液，將上清液緩慢滴加擴散至含2 mol·L-1尿素復性液中，滴加至蛋白濃度為0.8～1 mg·mL-1即可。復性完成后，蛋白經(jīng)透析，置換到PBS（pH 7.0）以備純化。

1.2.1.5 GM-CSF蛋白純化

選擇重組原核表達載體SUMO載體上含有6個組氨酸（His）標簽，可通過Ni-NTA柱親和層析，使用AKTA purifier100蛋白純化系統(tǒng)純化復性后的SUMO-GM-CSF蛋白。通過BCA計算濃度，按照質(zhì)量比1∶10加入SUMO蛋白酶，置于4℃冰箱過夜。第2天，將酶切后產(chǎn)物經(jīng)AKTA purifier 100蛋白層析系統(tǒng)，通過Ni-NTA柱二次親和，流穿液即為目的蛋白GM-CSF。取樣，作15%SDS-PAGE檢測。

1.2.2 FliC蛋白發(fā)酵誘導條件優(yōu)化及制備

1.2.2.1 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導時間確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開始誘導后，誘導溫度，IPTG濃度相同條件下，分別在誘導2、4、6、8 h時取發(fā)酵菌樣，制備誘導后全菌，誘導后上清蛋白樣品，通過15%SDS-PAGE電泳分析對比不同誘導時間對表達量影響。

1.2.2.2 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導IPTG濃度確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開始誘導后誘導溫度和時間相同條件下，分別加入終濃度為0.75、0.5、0.25 mmol·L-1IPTG。誘導放罐后取發(fā)酵菌樣制備誘導后全菌，誘導后上清蛋白樣品通過15%SDS-PAGE電泳分析，對比不同誘導劑終濃度對表達量影響。

1.2.2.3 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導溫度確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開始誘導后，誘導劑終濃度，誘導時間相同條件下，分別設置誘導溫度20、25、30、37℃。誘導放罐后取發(fā)酵菌樣，分別制備誘導后全菌，誘導后上清蛋白樣品，通過15%SDS-PAGE電泳分析，對比不同誘導溫度對表達量影響。

1.2.2.4 FliC蛋白純化

收集發(fā)酵培養(yǎng)的SUMO-FliC菌液，超聲破碎沉淀，純化融合蛋白。流穿液即為目的蛋白FliC。

1.2.3 GM-CSF與FliC蛋白作為復合生物佐劑免疫增強效果檢測

取5組BALB/c雌性小鼠，每組15只。

第1組為空白組，注射磷酸鹽；

第2組為單獨疫苗組，注射商品化豬圓環(huán)疫苗；

第3組為免疫佐劑①組，注射疫苗+GM-CSF（12.5 mg· kg-1）；

第4組為免疫佐劑②組，注射疫苗+FliC（5 mg·kg-1）；

第5組為GM-CSF與FliC混合疫苗組，注射疫苗+GM-CSF（12.5 mg·kg-1）+FliC（5 mg·kg-1）。

免疫程序：按照體重，采用皮下注射方法，五組分別注射磷酸鹽，單獨疫苗，疫苗+GM-CSF，疫苗+FliC及疫苗+GM-CSF+FliC。分別于D2、D4、D6、D8、D10眼球取血，每次每組取3只分離血清，通過ELISA方法檢測血清中抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導條件優(yōu)化及制備

2.1.1 誘導劑濃度

制備蛋白樣品作SDS-PAGE分析，如圖1所示，在約33 ku處有目的蛋白，且當IPTG終濃度為0.25 mmol·L-1時融合蛋白表達量最高。因此選擇IPTG 0.25 mmol·L-1為此蛋白最佳誘導劑濃度。

2.1.2 誘導溫度

制備蛋白樣品作SDS-PAGE分析。如圖2所示，在約33 ku處有目的蛋白，且當溫度為37℃時融合蛋白表達量最高。故選擇溫度為37℃作為此蛋白最佳誘導溫度。

圖1 誘導劑濃度確定Fig.1 Determination of inducer concentration

圖3 誘導溫度確定Fig.3 Determination of induced temperature

2.1.3 誘導時間

制備蛋白樣品，作SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在約33 ku處有目的蛋白，且誘導4 h時融合蛋白表達量高。故選擇誘導時間為4 h。根據(jù)SDS-PAGE分析，確定SUMO-GM-CSF蛋白最佳誘導條件為：IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度37℃，誘導4 h。

圖3 誘導時間確定Fig.3 Determination of induction time

2.1.4 SUMO-GM-CSF融合蛋白純化

將誘導后獲得SUMO-GM-CSF陽性菌體破菌離心，變性液復性液處理沉淀物，離心收集上清，過AKTA purfier 100系統(tǒng)經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析，得到純化后SUMO-GM-CSF融合蛋白，結(jié)果見圖4。將融合蛋白加入SUMO蛋白酶切除融合標簽后，二次親和層析得到最終GM-CSF蛋白。通過SDS-PAGE可知在約13 ku處有明顯目的條帶，如圖5所示。根據(jù)SDS-PAGE分析，得到純化后約13 ku GM-CSF蛋白。

圖4 SUMO-GM-CSF一次親和Fig.4 The first affinity of SUMO-GM-CSF

圖5 二次親和后GM-CSFFig.5 Obtained GM-CSF after the second affinity

2.2 SUMO-FliC融合蛋白發(fā)酵誘導條件優(yōu)化及制備

2.2.1 發(fā)酵誘導時間

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖6可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，且誘導6 h時融合蛋白表達量最高。

2.2.2 發(fā)酵誘導劑濃度

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖6可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，表達量無明顯差別，選擇最低IPTG終濃度0.25 mmol·L-1。

2.2.3 發(fā)酵誘導溫度

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖7可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，誘導溫度25℃時表達量最高。根據(jù)SDS-PAGE分析，確定SUMO-FliC蛋白發(fā)酵最佳誘導條件為IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度25℃，誘導6 h。

2.2.4 SUMO-FliC融合蛋白純化

破碎發(fā)酵培養(yǎng)所獲SUMO-FliC陽性菌體，將破碎后菌液置于中空纖維柱，收集澄清液體。將上清液通過AKTA purfier 100系統(tǒng)經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析得到純化后SUMO-FliC融合蛋白。將融合蛋白加入SUMO蛋白酶切除融合標簽后，二次親和層析得到最終FliC蛋白。通過SDS-PAGE可知在約46 ku處有明顯目的條帶，如圖8所示。根據(jù)SDS-PAGE分析，得到純化后約46 ku FliC蛋白。

圖6 誘導時間和誘導劑濃度確定Fig.6 Determination of induction time and inducer concentration

圖7 誘導溫度確定Fig.7 Determination of induced temperature

圖8 FliC蛋白純化SDS-PAGE電泳Fig.8 SDS-PAGE analysis of purfied FliC protein

2.3 GM-CSF與FliC蛋白作為復合生物佐劑免疫增強效果檢測

在小鼠免疫后第2、4、6、8、10天眼球取血，離心得到血清。經(jīng)ELISA測定不同組小鼠體內(nèi)抗體水平，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，免疫后第2天，與空白組相比，其他四組抗體效價均顯著升高，但疫苗+GM-CSF+FliC組增幅明顯大于單獨疫苗組和單獨佐劑組；第2～8天，單獨疫苗組抗體效價逐漸下降，復合佐劑組和單獨佐劑組穩(wěn)步上升；第8天時，復合佐劑組抗體效價達峰值，顯著高于其他各組；第10天，單獨疫苗組已失去免疫效果，但復合佐劑組維持較高水平。由此可見，GM-CSF和FliC均具有增強免疫效果生物學活性，且GM-CSF與FliC共同注射組較其他各組效果更好，迅速刺激小鼠免疫系統(tǒng)。

圖9 GM-CSF與FliC蛋白免疫小鼠10 d內(nèi)抗體變化Fig.9 Antibody titer after vaccination within 10 days

3 討 論

3.1 生物免疫佐劑選擇

獸用免疫佐劑包括鋁鹽佐劑、油乳佐劑、微生物類佐劑、中藥類佐劑、細胞因子類佐劑、化學合成類等。細胞因子作為機體內(nèi)重要因子，具有微量高效優(yōu)點，調(diào)控固有免疫反應及獲得性免疫反應效率高、副作用少。鞭毛蛋白作為免疫佐劑，不會對宿主產(chǎn)生超敏反應，可增強抗原呈遞細胞對外來抗原攝取、加工和遞呈能力；低劑量亦可發(fā)揮佐劑效應[24-25]。

本研究選擇粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）與鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白（FliC）作為生物免疫佐劑，與單獨疫苗組相比，添加生物免疫佐劑有效增加疫苗免疫效果，提高抗體效價，起效迅速且延長免疫作用時間，在第8天至第10天單獨疫苗組已失去作用時，GM-CSF+FliC作為生物佐劑仍保持相對較高水平。

3.2 復合免疫佐劑應用

本試驗選用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白（FliC），GM-CSF可有效促進抗原遞呈，F(xiàn)liC可誘導產(chǎn)生細胞因子，作為復合生物佐劑聯(lián)合使用時，免疫效果增強。本研究中，對比疫苗+GM-CSF組使用效果，GM-CSF+FliC復合生物佐劑對疫苗免疫效果更強；對比GM-CSF單獨作為佐劑，GM-CSF+FliC具有免疫作用持久和高水平應答等優(yōu)點。兩種以上免疫佐劑混合成復合佐劑，可有效發(fā)揮疫苗增強作用。

防控豬圓環(huán)病毒關鍵是疫苗免疫，但全病毒滅活疫苗免疫效果不理想，難以獲得高效價抗體水平[26]。本研究改良豬圓環(huán)病毒疫苗效果，復合生物佐劑可有效提高疫苗效果，到達預期目的，解決多數(shù)動物疫苗抗原性差、作用時間短等問題，為養(yǎng)殖動物疫苗改良應用提供新思路。

3.3 發(fā)酵工程應用

發(fā)酵工程作為產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化必要手段，其合理應用可節(jié)省人力物力。利用發(fā)酵罐擴大產(chǎn)品獲取量，經(jīng)發(fā)酵得到蛋白濃度高，避免后期煩瑣濃縮過程及產(chǎn)品浪費。近年來，隨著大腸桿菌基因重組技術與高密度發(fā)酵技術結(jié)合，天然蛋白可大量生產(chǎn)。重組大腸桿菌細胞高密度發(fā)酵培養(yǎng)是獲得高外源性蛋白產(chǎn)率的重要方法，可減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

4 結(jié)論

本研究確定GM-CSF和FliC蛋白最佳表達條件，即GM-CSF在IPTG終濃度為0.25 mmol·L-1、溫度為37℃時誘導4 h，F(xiàn)liC在IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度為25℃時誘導6 h，成功制備具有生物活性的GM-CSF和FliC蛋白。GM-CSF+FliC作為復合生物佐劑與豬圓環(huán)病毒疫苗共同注射小鼠，有效增強體液免疫，可作為新型復合佐劑。