張 穎,楊雙雙,王 蕾,付嘉偉,李 瑞,張 杏,薛越文,劉璐瑤
(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150030)
隨著塑化制品需求增多,鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物(Phthalate ester,PAEs)應(yīng)用廣泛。其可源于生物自然合成和人工合成,環(huán)境中存在PAEs主要由人工合成途徑產(chǎn)生[1-2]。長(zhǎng)鏈烴鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)因強(qiáng)耐塑性而應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域,軟質(zhì)PVC產(chǎn)品中添加量高達(dá)40%,其產(chǎn)量占全球PAEs生產(chǎn)總量40%[3-4]。DEHP具有較強(qiáng)生物毒性及三致效應(yīng)[5],為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[6-7]。DEHP與塑料通過(guò)氫鍵和范德華力連接,隨時(shí)間和環(huán)境變化,PAEs易脫離[8],DEHP在生物體組織中積累,在大氣-水體系、蒸汽相-大氣懸浮顆粒物體系、水-沉積物土壤體系中遷移,造成環(huán)境污染[9]。常規(guī)處理DEHP方法有物理吸附、光解、水解、臭氧氧化和生物降解法,其中生物降解法研究較多。
生物吸附技術(shù)具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單易操作、效率高等特點(diǎn)。Ruchhoft最早提出“生物吸附”,發(fā)現(xiàn)污泥可高效去除廢水中239Pu,去除率達(dá)96%,原因是大量微生物繁殖形成較大面積凝膠網(wǎng)具有吸附作用[10]。研究發(fā)現(xiàn),啤酒酵母可生物吸附大多數(shù)有毒重金屬,吸附機(jī)理主要是離子交換、酶促機(jī)理、表面絡(luò)合、無(wú)機(jī)微沉淀等[11]。曲娟娟等發(fā)現(xiàn)黑曲霉廢棄菌絲體作吸附劑,廢水中Pb2+吸附率高達(dá)91.5%[12]。生物吸附有機(jī)污染物研究起步相對(duì)較晚,主要研究廉價(jià)生物吸附材料及改性方法,探討吸附機(jī)制及影響因素。Luo等發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克霍爾德菌活菌體和死菌體對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯具有生物吸附作用,在30 min內(nèi)可達(dá)最大吸附量,吸附率超過(guò)80%[13]。生物吸附劑不僅包括藻酸鈣、細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)以及細(xì)胞提取物,還包括殼聚糖、纖維素、莢膜多糖、植物多糖和細(xì)菌胞外多糖等物質(zhì),隨著生物吸附研究深入,發(fā)現(xiàn)胞外聚合物,殼聚糖等物質(zhì)對(duì)有機(jī)物、重金屬等污染物均具有較強(qiáng)吸附能力。
胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)由微生物分泌,包括大分子細(xì)胞裂解和水解產(chǎn)物及吸附在細(xì)胞壁上有機(jī)物質(zhì),包被在細(xì)菌外層的復(fù)雜高分子有機(jī)聚合物[14]。EPS表面有荷電官能團(tuán)如羧基、羥基、硫酸基、磷酸基、氨基等,非極性官能團(tuán)如芳烴,蛋白中脂肪族化合物及多糖中疏水區(qū)域,為吸附有機(jī)物提供有利條件[15]。Flemming等報(bào)道,60%以上苯、甲苯和間二甲苯均被EPS吸附,僅部分污染物被細(xì)菌細(xì)胞吸附[16]。Zhang等報(bào)道稱(chēng)原位接種PAHs細(xì)菌產(chǎn)生胞外聚合物可除去土壤中PAHs[17]。目前EPS吸附鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物研究較少,本研究通過(guò)提取DEHP降解菌Arthrobacter sp.JQ-1胞外聚合物吸附DEHP試驗(yàn),探討EPS與DEHP相互作用機(jī)制,為PAEs污染生物修復(fù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
1.1.1 菌株
本試驗(yàn)菌株來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)原香坊實(shí)習(xí)實(shí)驗(yàn)基地大棚,從土壤篩選出以DEHP為唯一碳源降解菌,命名為Arthrobacter sp.JQ-1。
1.1.2 無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基
K2HPO4·3H2O 1 g·L-1,NaCl 0.4 g·L-1,NH4NO30.5 g·L-1,F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1,CaCl2·2H2O 0.075 g·L-1。
1.1.3 試劑
DEHP(分析純)購(gòu)自天力化學(xué)試劑科技有限公司,正己烷、無(wú)水硫酸鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、牛血清蛋白、腐殖酸、脫氧-D-核糖等,均為分析純,購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠。
1.1.4 主要儀器與設(shè)備
恒溫振蕩器購(gòu)自上海市一恒科技有限公司;滅菌鍋購(gòu)自上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司;UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司;低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Beckman公司;水浴鍋購(gòu)自上海予英儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)購(gòu)自上海比朗儀器制造有限公司;LC-20ADXR型液相色譜儀購(gòu)自日本島津公司。
1.2.1 EPS提取
將凍存Arthrobacter sp.JQ-1菌種先活化培養(yǎng),接入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在溫度35℃,pH 7,125 r·min-1,DEHP 1 000 mg·L-1,接菌量4%最佳生長(zhǎng)條件下,搖瓶培養(yǎng)72 h。達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后,將制備菌懸液分批倒入50 mL離心管中5 000 r·min-1離心10 min進(jìn)一步濃縮,逐次累計(jì)菌體沉淀倒去上清液直至全部菌懸液離心結(jié)束,再將蒸餾水補(bǔ)充至40 mL,渦旋儀打勻后5 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)3次,清洗菌體,然后將清洗過(guò)菌懸液60~70℃水浴加熱,15 min后5 000 r·min-1離心15 min,取上清液,0.22 μm透析袋(3 500 DA),去離子水中透析48 h,每隔12 h換1次水,最后收集透析后液體冷凍干燥,配制得到0.5 g·L-1EPS純樣品溶液。
1.2.2 EPS組分測(cè)定
EPS組分主要包括多糖、蛋白質(zhì)、腐殖酸、DNA等,多糖采用硫酸—苯酚法[18];蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[19];腐殖酸測(cè)定采用修正Folin-Lowry法[20];DNA測(cè)定采用二苯胺法;總磷測(cè)定采用中性過(guò)硫酸鉀消解-紫外分光光度法[21]。
1.2.3 EPS對(duì)DEHP吸附試驗(yàn)
向50 mL玻璃錐形瓶加入配制完成EPS純樣品溶液(0.5 g·L-1)30 mL,一定濃度DEHP,不同溫度和pH下試驗(yàn),在恒溫振蕩器中以125 r·min-1振蕩72 h,收集樣品8 000 r·min-1離心15 min,取上清液與正己烷(1∶1)加入比色管中,渦旋震蕩,吸取上層液相,過(guò)無(wú)水Na2SO4測(cè)定DEHP含量,設(shè)置3個(gè)平行,空白樣品不加吸附劑。
取0.5 g·L-1EPS溶液30 mL,加入不同濃度DEHP,在25℃恒溫振蕩器中以125 r·min-1振蕩,分別在3、6、9、12、18、24、36、48、60、72 h取樣,樣品8 000 r·min-1離心15 min取上清液萃取,3個(gè)平行,空白樣不加吸附劑。
1.2.4 吸附動(dòng)力學(xué)與熱力學(xué)
EPS吸附量和DEHP吸附率采用吸附前后液相中DEHP濃度計(jì)算得到:
其中,qt為t時(shí)刻EPS吸附量(mg·g-1);A為DEHP吸附率(%);C0為溶液初始DEHP濃度(mg·L-1);Ct為t時(shí)刻溶液中DEHP濃度(mg·L-1);V為溶液體積(mL);m為投加吸附劑EPS量(mg);達(dá)到吸附平衡時(shí),Ct和qt分別表示為Ce和qe。
吸附動(dòng)力學(xué)可描述吸附劑對(duì)吸附質(zhì)吸附速率,該速率決定吸附平衡時(shí)間[23]。
準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型為
準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型為
其中,K1和K2為吸附速率常數(shù)(g·mg-1·min-1);qe為平衡時(shí)吸附量(mg·g-1);qt為 t時(shí)刻吸附量(mg·g-1)。
Freundlich和Langmuir等溫吸附方程是應(yīng)用最為廣泛等溫吸附方程[23-24]。
Freundlich吸附等溫模型為
其中,qe為平衡時(shí)吸附量(mg·g-1);Ce為DEHP平衡濃度(mg·L-1);qmax為吸附劑EPS最大吸附量(mg·g-1);Kf和n為Freundlich等溫吸附方程常數(shù);Kl為L(zhǎng)angmuir等溫吸附方程常數(shù)。
動(dòng)力學(xué)分析分別采用一級(jí)和二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合,熱力學(xué)分析分別采用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型擬合。
采用液相質(zhì)譜(LC-MS)法測(cè)定各處理下DEHP含量,LC-MS具體條件為:色譜柱:Kinetex C18(150 mm×3.0 mm,2.6 μm,100 A);流動(dòng)相:甲醇(0.1%FA);流速:200 μL·min-1;進(jìn)樣量10 μL[25]。將各處理樣品冷凍干燥,與溴化鉀粉末充分混合
Langmuir吸附等溫模型為后壓片,采用傅里葉紅外光譜(FTIR)分析官能團(tuán)。數(shù)據(jù)運(yùn)用Microsoft Excel 2013、Origin Pro 8統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。
經(jīng)加熱提取法提取EPS,配制純樣品溶液(0.5 g·L-1)測(cè)定組分,其主要成分含量見(jiàn)表1。
表1 EPS主要成分含量Table 1 Main components of EPS
由表1可知,測(cè)定EPS 5種成分中,蛋白質(zhì)含量最高,約占EPS總量40%,原因是EPS上官能團(tuán)為DEHP提供吸附位點(diǎn),用DEHP培養(yǎng)Arthrobacter sp.JQ-1菌株時(shí)刺激蛋白質(zhì)產(chǎn)生,多糖和腐殖酸含量較蛋白質(zhì)含量稍低,約為EPS總量20%和16%,說(shuō)明3種成分是EPS主要組分。這些大分子物質(zhì)產(chǎn)生黏性力形成三維帶電絮體基質(zhì),帶有非極性官能團(tuán),有利于有機(jī)污染物吸附。EPS中DNA含量可間接反映EPS提取過(guò)程中細(xì)胞溶胞程度,當(dāng)DNA含量占總提取EPS比例極低時(shí),EPS提取過(guò)程無(wú)嚴(yán)重溶胞現(xiàn)象。Arthrobacter sp.JQ-1提取EPS中,DNA含量極低,說(shuō)明加熱提取法未使細(xì)胞過(guò)多裂解,是提取EPS有效法。
圖1 溫度和pH對(duì)DEHP吸附率的影響Fig.1 Effect of temperature and pH on the adsorption of DEHP
不同溫度EPS對(duì)100 mg·L-1DEHP吸附情況見(jiàn)圖1a。可見(jiàn)在15~25℃時(shí)EPS對(duì)DEHP吸附率隨溫度增加而增加,25、30、35℃吸附率均超過(guò)75%,但25℃時(shí)吸附率高達(dá)85%,效果最好。這是由于溫度升高加快粒子擴(kuò)散和碰撞,更有利于吸附[26];當(dāng)溫度>30℃,EPS上活性吸附位點(diǎn)減少,因此常溫處理DEHP效果較好。
在25℃,DEHP質(zhì)量濃度100 mg·L-1,EPS濃度0.5 g·L-1,125 r·min-1,不同pH條件下試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1b。pH 5~7時(shí),DEHP吸附率從45%增至85%,pH為7時(shí)吸附率達(dá)到最高,在85%左右。推測(cè)是pH較低情況下,EPS上原本DEHP吸附位點(diǎn)被溶液中大量H+爭(zhēng)奪,EPS表面質(zhì)子化,表面斥力增加,吸附率較低[27]。pH較高時(shí)吸附率較低,并非有利吸附條件,原因是隨溶液中堿性增強(qiáng),表面靜電引力吸附被削弱。中性和弱酸條件下,EPS與DEHP作用最強(qiáng),吸附量達(dá)到最大。
溫度25℃,DEHP濃度100 mg·L-1,pH 7條件下隨時(shí)間改變,EPS對(duì)DEHP吸附量變化,結(jié)果見(jiàn)圖2。EPS對(duì)DEHP吸附過(guò)程大致分為極快、快、慢3個(gè)階段,在最初12 h內(nèi)吸附量增加速度快,隨時(shí)間延長(zhǎng)吸附量由緩慢增加至達(dá)到平衡,最大吸附量達(dá)到170.14 mg·g-1,平衡時(shí)間36 h,為確保試驗(yàn)結(jié)果可靠性,選取48 h作為吸附平衡時(shí)間。
擬合不同濃度DEHP吸附動(dòng)力學(xué)方程,探討吸附過(guò)程基本機(jī)制結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3b可知,EPS對(duì)DEHP吸附動(dòng)力學(xué)擬合曲線呈線性,更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型依據(jù)吸附量與非吸附量比例建立;準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型則以化學(xué)反應(yīng)機(jī)制為基礎(chǔ),設(shè)定吸附率被吸附劑與吸附質(zhì)間共享和交換電子化學(xué)反應(yīng)控制。
由表2可知,一級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬決定系數(shù)較低,各濃度下擬合方程決定系數(shù)均未達(dá)到0.90;而二級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果更好,各濃度下擬合方程決定系數(shù)在0.98以上,隨DEHP初始濃度增加K2減小,qe增加,說(shuō)明EPS吸附DEHP過(guò)程符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。產(chǎn)生化學(xué)機(jī)制是EPS上存在活性官能團(tuán)(羧基、羥基)與DEHP分子結(jié)合,但EPS、DEHP含有高負(fù)電性含氧有機(jī)官能團(tuán)也可通過(guò)物理作用(范德華力、氫鍵)使EPS與DEHP相互作用。
圖2 DEHP在EPS中吸附動(dòng)力學(xué)特性Fig.2 Adsorption dynamic characteristic of DEHP
圖3 準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型Fig.3 Pseudo-first order and Pseudo-second order kinetics model of adsorption
表2 吸附速率方程擬合參數(shù)Table 2 Fitting values by kinetic models
25℃下EPS在吸附DEHP達(dá)平衡濃度時(shí)吸附等溫線見(jiàn)圖4。
由圖4可知,F(xiàn)reundlich和Langmuir等溫模型中Freundlich擬合效果較好。其中,Langmuir模型以等溫條件下吸附劑質(zhì)地均勻且與吸附質(zhì)無(wú)任何作用力,屬于單層分子吸附,可以化學(xué)吸附和物理吸附;Freundlich等溫模型用于非理想條件下表面吸附及多分子層吸附,可用于物理吸附和化學(xué)吸附。各模擬方程及決定系數(shù)見(jiàn)表3。Langmuir等溫模型模擬方程決定系數(shù)為0.9921,相對(duì)較差,F(xiàn)reundlich模擬方程決定系數(shù)為0.9945,EPS吸附DEHP等溫模型更符合Freundlich。說(shuō)明EPS對(duì)DEHP吸附并非單層吸附。Kf值常代表吸附劑對(duì)吸附質(zhì)親和力,表中Kf值較高,說(shuō)明EPS對(duì)DEHP具有很強(qiáng)親和力;n值>1說(shuō)明DEHP在EPS上吸附向有利方向發(fā)展。
圖4 Freundlich和Langmuir等溫方程擬合結(jié)果Fig.4 Fitting results of Freundlich and Langmuir isotherm equation
表3 不同吸附模型擬合EPS對(duì)DEHP吸附熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Isotherm constants of various models of biosorption
EPS吸附DEHP紅外光譜圖(500~4 000 cm-1)見(jiàn)圖5。FTIR觀察到主要波峰對(duì)應(yīng)EPS基團(tuán)見(jiàn)表4。由圖5和表4可知,不同DEHP濃度下EPS在3 500~3 200 cm-1時(shí)出現(xiàn)較寬吸收帶,寬峰來(lái)自-OH伸縮振動(dòng),來(lái)自蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸等組分。2 917~2 931 cm-1是-CH2-振動(dòng),來(lái)自于脂類(lèi)。典型酰胺Ⅰ帶(C=O伸展振動(dòng))和酰胺Ⅱ帶(-NH彎曲振動(dòng)與-CN伸展振動(dòng)疊加)分別出現(xiàn)1 660~1 600和1 520~1 550 cm-1處,1 385 cm-1是蛋白質(zhì)中C=O對(duì)稱(chēng)振動(dòng),1 047~1 123 cm-1為多糖C-O-C伸縮振動(dòng)和C-O伸縮振動(dòng)峰。在FTIR光譜指紋區(qū)存在含磷或含硫基團(tuán),是EPS中少量脂類(lèi)和核酸。當(dāng)EPS吸附不同濃度DEHP時(shí),光譜圖峰域,存在漂移,說(shuō)明DEHP存在使EPS上各類(lèi)基團(tuán)與其相互作用,其中羥基、羧基和羰基等基團(tuán)起主要作用,這些基團(tuán)主要位于蛋白質(zhì)和多糖等組分中,吸附過(guò)程較重要。
圖5 EPS吸附DEHP紅外光譜Fig.5 FTIR image of EPS adsorption DEHP
表4 FTIR圖觀察到EPS主要基團(tuán)Table 4 The main functional groups of EPS observed in FTIR spectra
通過(guò)加熱提取DEHP高效降解菌Arthrobacter sp.JQ-1胞外聚合物,發(fā)現(xiàn)EPS組分中蛋白質(zhì)>多糖>腐殖酸,蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%,與張燕等[28]研究Ca2+對(duì)生物膜組分影響中,蛋白質(zhì)含量高于多糖結(jié)果相似。與Wen等測(cè)定生物膜成分時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量總是高于多糖一致[29]。張俊珂等發(fā)現(xiàn),受四環(huán)素影響活性污泥胞外聚合物組分中,EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量均高于IPS,蛋白質(zhì)較多糖含量高[30]。EPS主要成分有多糖、蛋白質(zhì)、腐殖酸,其中蛋白質(zhì)成分均具有帶負(fù)電荷氨基酸、疏水性氨基酸和少量親水性電中性氨基酸,多糖中帶陰離子特性基團(tuán),與多價(jià)陽(yáng)離子間相互作用顯著增強(qiáng)EPS分子間穩(wěn)定性。EPS表面帶多荷電基團(tuán),有助于吸附有機(jī)污染物。
環(huán)境因素中溫度和pH影響EPS吸附DEHP。過(guò)高或過(guò)低溫度條件吸附率較低,原因是EPS上活性位點(diǎn)減少,不利于吸附DEHP,室溫下則達(dá)到最大吸附率最適溫度。初始pH是生物吸附研究重要因素,因其影響細(xì)菌表面化學(xué)性質(zhì)和溶液中吸附質(zhì)溶解度,改變DEHP對(duì)生物吸附劑親和力。EPS由多糖、蛋白質(zhì)和含有許多官能團(tuán)脂質(zhì)組成,包括羥基、羧基、磷酸酯和氨基,對(duì)pH依賴(lài)性較強(qiáng)。DEHP是非離子化合物,在中型條件下較穩(wěn)定,但在低或高pH條件下可發(fā)生酸或堿性水解,使EPS上吸附位點(diǎn)被搶占,吸附率降低。研究表明PAEs吸附可用疏水和分散作用解釋[31]。根據(jù)Moreno-Castilla中性條件下對(duì)DBP吸附主要?dú)w因于疏水作用,其特征在于吸附劑表面疏水性位點(diǎn)和DBP非極性烷基間異常強(qiáng)吸引力[32]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),pH中性條件下,EPS對(duì)DEHP吸附率最高,因EPS表面非極性官能團(tuán),包括芳香族化合物、蛋白質(zhì)中脂肪族、多糖疏水區(qū)域與DEHP主要通過(guò)疏水作用結(jié)合。Pan等報(bào)道EPS與菲之間相互作用是自發(fā)放熱,結(jié)合主要是疏水作用[33]。EPS親疏水性影響有機(jī)物吸附,本文中EPS蛋白質(zhì)含量高,其中疏水區(qū)域占較大比重,因此更利于DEHP吸附。
本文通過(guò)研究EPS對(duì)DEHP吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)發(fā)現(xiàn),EPS對(duì)DEHP吸附符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)和Freundlich等溫模型,化學(xué)和物理機(jī)制共同作用,對(duì)DEHP吸附并非單層吸附。較大Kf值代表EPS對(duì)DEHP具有很強(qiáng)親和力,是吸附劑和吸附質(zhì)共同作用結(jié)果,主要是疏水鍵力、氫鍵力和范德華力之間作用。王士東等研究好氧污泥胞外聚合物對(duì)玫瑰紅B染色劑吸附發(fā)現(xiàn),其過(guò)程符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)和Freundlich等溫模型,與本文結(jié)果一致[34]。
根據(jù)傅里葉紅外光譜峰值振動(dòng),說(shuō)明EPS和DEHP之間起主要作用的是羥基、羧基和羰基等基團(tuán),這些基團(tuán)主要位于蛋白質(zhì)、多糖等組分中,進(jìn)一步證明EPS組分與DEHP發(fā)生作用,參與吸附過(guò)程。
DEHP高效降解菌Arthrobacter sp.JQ-1提取EPS組分主要為蛋白質(zhì)、多糖、腐殖酸,這些組分含有許多官能團(tuán),有利于吸附有機(jī)污染物。EPS吸附DEHP最佳條件為pH 7,25℃。EPS對(duì)DEHP吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)和Freundlich等溫模型,化學(xué)和物理機(jī)制共同作用,主要是疏水鍵力、氫鍵力和范德華力之間作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,EPS對(duì)處理酞酸酯類(lèi)化合物效果良好,可作為鄰苯二甲酸酯類(lèi)有機(jī)污染物生物吸附劑。