藏豬IFN-λ3成熟肽基因克隆及原核表達(dá)、抗病毒效價測定

李原野， 殷 玥， 陳瑛琪， 張繼宗，楊曉宇，王佳煜，朱 玲,2， 徐志文,2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130，2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

Ⅲ型與Ⅰ型干擾素生物學(xué)功能相似，但Ⅲ型干擾素受體廣泛分布于上皮組織和器官，具有更強的特異性，在造血和神經(jīng)系統(tǒng)分布較少，臨床應(yīng)用副作用較小。Ⅲ型干擾素抗病毒活性研究發(fā)現(xiàn)，IFN-λ3抗病毒活性顯著高于IFN-λ1和 IFN-λ2。根據(jù)干擾素抗豬水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）活性測定干擾素效價[1]，VSV系統(tǒng)對各種干擾素敏感度較高，活性測定效果較好[2]。IFN-λ屬于Ⅱ類細(xì)胞因子，其與Ⅰ型干擾素具有相似抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能，其特異性受體IFN-λR1主要在上皮細(xì)胞組織表達(dá)，在黏膜表面表現(xiàn)特異性的抗病毒功能[3-4]。豬IFN-λ包括IFN-λ1和IFN-λ3，后者抗病毒活性更強[5]。Wang等在豬外周血淋巴細(xì)胞中克隆得到IFN-λ1基因[6]，Shen等利用 Poly I：C誘導(dǎo)ST細(xì)胞克隆 IFN-λ3基因[7]。目前，關(guān)于豬IFN-λ其他成員尚未見報道。Ⅰ型干擾素已用于治療多種臨床疾病，如慢性髓性白血病、黑色素瘤、丙型肝炎等[8-9]。

本文首次以提取藏豬肺臟和腸道總RNA為模板，通過RT-PCR方法成功獲取藏豬IFN-λ3基因序列。以pMD19-T-ZPoIFN-λ3質(zhì)粒為模板，克隆ZPoIFN-λ3成熟肽基因（pMD19-T-mZPoIFN-λ3），構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3，于大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，純化重組質(zhì)粒，并通過MDBK/VSV系統(tǒng)測定其抗病毒效價，為進(jìn)一步研究藏豬IFN-λ3生物學(xué)特性和相關(guān)基因重組藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 肺臟、質(zhì)粒與菌株

藏豬肺臟和腸采自四川省甘孜自治州規(guī)?；i場，E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、質(zhì)粒pMD19-T、表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心保存。

1.2 酶和試劑

PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker DL2000、GoldViewTM染色劑、TaKaRa RNAisoTM Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.1、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶QuickCut?Bam HⅠ、Quick Cut?HindⅢ、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；辣根HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)高交叉吸附二級抗體購自賽默飛世爾（中國）公司。

1.3 PCR引物

根據(jù)GenBank公布的豬IFN-λ3序列（NM_001166490），利用Primer 5.0設(shè)計擴增藏豬IFN-λ3全長序列引物。引物序列如下：P1：5'ATGGCCCT GGGTGGCT 3'， P2：5'TCAGACACACAGGTCTCC AC 3'。P1和P2由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)克隆到的藏豬IFN-λ3基因序列，設(shè)計擴增藏豬IFN-λ3成熟肽基因引物。分別在上游引物（P3）和下游引物（P4）5'端加Bam HⅠ和HindⅢ酶切位點。P3：5'CGCGGATCCGTGCCTGTCCCT GAAGCCC 3'，（劃線部分為Bam HⅠ酶切位點）P4：5'CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC 3'（劃線部分為HindⅢ酶切位點）P3和P4由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 藏豬肺和腸總RNA提取及cDNA合成

取新鮮藏豬肺臟和腸道組織，液氮反復(fù)研磨，取100 mg組織置于EP管中，參照試劑盒說明書提取肺和腸組織總RNA、純化肺和腸組織的RNA，1%瓊脂糖電泳（AGE）檢查。以總RNA提取液3 μL為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s）。

1.5 pMD19-T-ZPoIFN-λ3質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

以cDNA為模板，擴增IFN-λ3全基因（反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10 pmol·μL-1P1、P2 各 1 μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL;反應(yīng)條件：95℃，5 min；95℃，30 s；54℃ ，30 s；72℃，40 s；35個循環(huán)；72℃，10 min），預(yù)期產(chǎn)物約600 bp。PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD19-T載體連接，再轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，陽性單菌落經(jīng)PCR測序鑒定，克隆命名為pMD19-T-ZPoIFN-λ3。

1.6 IFN-λ3成熟肽基因擴增及重組表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD19-T-ZPoIFN-λ3為模板，作藏豬IFN-λ3成熟肽基因擴增（反應(yīng)體系：2 μL pMD19-TZPoIFN-λ3，上下游引物（10 pmol· μL-1）P3、P4各 1 μL， 12.5 μL PrimeSTAR Max Premix， 6 μL ddH2O，反應(yīng)條件95℃，7 min；95℃，30 s；65℃，30 s；72℃，40 s；共30個循環(huán)；72℃，10 min；4℃，保存），擴增產(chǎn)物經(jīng)1%AGE鑒定后回收純化。將IFN-λ3成熟肽PCR產(chǎn)物和載體PET-32α(+)用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和HindⅢ在37℃條件下酶切30 min（雙酶切體系為IFN-λ3/PET-32α 1 μg，10×酶切Buffer 2 μL，Bam HⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL），將IFN-λ3酶切片段與PET-32α(+)酶切產(chǎn)物于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli.BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于LB平板（含Amp 100 μg·mL-1），37 ℃恒溫需氧培養(yǎng)12～24 h。挑取單個菌落接種于LB肉湯（含Amp），37℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 12～14 h，取菌液作 PCR 鑒定，取陽性轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，Bam HⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將菌落PCR與雙酶切鑒定正確的陽性克隆轉(zhuǎn)化子送上海生工測序。

1.7 誘導(dǎo)劑IPTG濃度及誘導(dǎo)表達(dá)時間優(yōu)化

將重組菌BL21-IFN-λ3接種于LB肉湯（含Amp）37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，按1∶100比例轉(zhuǎn)種至LB肉湯（含Amp）中培養(yǎng)OD600=0.6時，加入IPTG使終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)5 h，收集菌體作全菌SDS-PAGE分析。當(dāng)重組菌BL21-IFN-λ3培養(yǎng)至OD600=0.6時，加入IPTG溶液使終濃度達(dá)優(yōu)化后水平，誘導(dǎo)至1、2、3、4、5 h時，分別取1 mL菌液作SDSPAGE檢測分析。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物定位分析及Western Blot鑒定

優(yōu)化后結(jié)果作重組菌BL21-IFN-λ3培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，4℃12 000 r·min-1（Sigma 3k15 Inc）離心10 min，棄上清，用1/10體積PBS（pH 8.0）重懸沉淀，加入適量裂解液，冰浴下超聲破碎至溶液清澈。4℃ 12 000 r·min-1離心15 min收集上清和沉淀，沉淀用PBS重懸。取少量上清液和沉淀重懸液，加入等體積5×Loading Buffer，SDS-PAGE分析。破碎后離心收集上清，加入等體積平衡緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，8 mol·L-1尿素，500 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1咪唑，pH 8.0）混勻，0.45 nm濾膜過濾，濾液按照上海生工公司Ni-NTA SefinoseTM Resin Kit試劑盒使用說明操作。洗脫蛋白經(jīng)10 ku超濾管濃縮。將誘導(dǎo)表達(dá)和未誘導(dǎo)產(chǎn)物與純化融合蛋白作SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)PVDF膜，后作Western Blot分析，一抗為鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFN-λ3全基因及成熟肽序列擴增

以抽提藏豬肺和腸組織RNA為模板，RT-PCR擴增IFN-λ3基因全長序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%AGE檢測，約600 bp位置處出現(xiàn)與預(yù)期長度相符單一條帶（見圖1）。將目的片段擴增至克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對轉(zhuǎn)化子作菌落PCR鑒定（見圖2），陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術(shù)公司測序，獲得堿基序列為612 bp，將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站Blast比對，使用MEGA 5.0等軟件，將本研究序列與GenBank中已發(fā)表野豬（NM_0011664 90.1）、牛（NM_001281901.1）、樹鼩（JX185489.1）、人（AY184374.1）、小鼠（NM_177396.1）、獅頭雞（NM_001128496.1）、人（AY184374.1）、西方爪蟾（NM_001171766.1）IFN-λ3的作同源性分析（見圖3），構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖4）結(jié)果顯示，藏豬IFN-λ3與野豬、牛、樹鼩、人、小鼠、獅頭雞和西方爪蟾核酸序列相似性分別為100%、84.9%、80.2%、78.9%、72.5%、51.8%、43.1%，表明克隆成功，以P3/P4為引物，pMD19-T-IFN-λ3為模板擴增IFN-λ3成熟肽序列，擴增得到1條約500 bp條帶，與預(yù)期相符（見圖5），未加模板陰性對照未見條帶，說明成功擴增IFN-λ3成熟肽。

圖1 藏豬IFN-λ3 PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Tibetan pig IFN-λ3 gene

圖2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3

圖3 目的基因同其他物種序列同源性比較Fig.3 Homologies of target genes with other species sequences

圖4 ZPoIFN-λ3氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic ree based on amion acid sequence of ZPoIFN-λ3

圖5 藏豬IFN-λ3成熟蛋白基因PCR擴增Fig.5 PCR amplification of Tibetan pig IFN-λ3 mature peptide sequence

2.2 重組表達(dá)載體pET32α-IGF-1構(gòu)建與鑒定

回收成熟肽基因片段與質(zhì)粒pET-32α(+)分別雙酶切后，連接酶連接，獲取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli.BL21（DE3），陽性菌株作菌落PCR鑒定，另小量提取質(zhì)粒后用Bam HⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，均可得到約500 bp IFN-λ3序列片段，與預(yù)期產(chǎn)物一致（見圖6、7），質(zhì)粒送公司測序鑒定，正確轉(zhuǎn)化子命名為BL21-IFN-λ3。

2.3 藏豬IFN-λ3融合蛋白IPTG濃度優(yōu)化

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8或1.0 mmol·L-1的IPTG，搖床中37 ℃誘導(dǎo)5 h。SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPTG終濃度為0.4 mmol·L-1時目的蛋白表達(dá)量最大（見圖8）。

圖6 pMD19-T-mZPoIFN-λ3 PCR鑒定Fig.6 PCR identification of the pMD19-T-mZPoIFN-λ3

圖7 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3酶切鑒定Fig.7 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3 by restriction enayme digestion

圖8 IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)影響Fig.8 Effect of recombinant protein expression with different concentration of IPTG

2.4 IFN-λ3融合蛋白誘導(dǎo)時間優(yōu)化

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，在空氣搖床中37℃條件下誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后1、2、3、4、5 h分別取樣作SDS-PAGE分析，不同誘導(dǎo)時間均有目的蛋白表達(dá)且呈時間依賴，誘導(dǎo)5 h蛋白表達(dá)量最多（見圖9）。選擇5 h作為最佳誘導(dǎo)時間。

2.5 重組蛋白純化和Western Blot鑒定

利用融合蛋白組氨酸標(biāo)簽，將洗滌后包涵體通過Ni-NTA親和層析法去除雜蛋白，250 mmol·L-1咪唑洗脫液洗脫，洗脫液通過SDS-PAGE檢測為單一條帶（見圖10）。洗脫蛋白通過透析法復(fù)性以及PEG-20000濃縮，使用考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白濃度為1.13 mg·mL-1。純化后融合蛋白制備鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗體，將純化pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表達(dá)藏豬IFN-λ3成熟蛋白經(jīng)12%SDSPAGE電泳分離后，置于轉(zhuǎn)膜槽中冰浴轉(zhuǎn)膜，90 V電壓轉(zhuǎn)膜40 min，使用鼠高免血清作為一抗，作Western Bolting鑒定，發(fā)現(xiàn)在目的蛋白處出現(xiàn)條帶（見圖10），說明原核表達(dá)的藏豬IFN-λ3融合蛋白具有良好免疫原性。

圖9 誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)影響Fig.9 Effect of recombinant protein expression with different culture times

圖10 檢測復(fù)性濃縮后藏豬IFN-λ3重組蛋白Fig.10 Detection of renaturation recombination protein of Tibetan procine IFN-λ3

2.6 重組IFN-λ3蛋白抗病毒活性效價測定

pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表達(dá)藏豬IFN-λ3融合蛋白抗病毒效價采用細(xì)胞病變抑制法，使用VSV/MDBK系統(tǒng)測定（見圖11）。

通過計算可得，距離比＝（高于50%的百分比-50）/（高于50%的百分比-低于50%的百分比）＝（75-50）/（75-25）＝0.5，pET-32a(+)-mPoIFN-λ3表達(dá)蛋白在MDBK/VSV系統(tǒng)抗病毒效價為10×24.5U·0.1 mL-1，蛋白質(zhì)濃度為1.13 mg·mL-1，比活力為2×103U·mg-1（見表1）。

圖11 MDBK細(xì)胞CPE觀察Fig.11 Observation of MDBK cell CPE

表1 ZPoIFN-λ3抗病毒活性效價測定Table 1 Determination of ZPoIFN-λ3 antiviral effect

3 討論與結(jié)論

藏豬為世界少有高原型原始放牧豬種，是我國唯一生活在高原高寒地區(qū)的地方小型原始豬種，具有對惡劣環(huán)境適應(yīng)力強、抗病力強及耐粗飼等特點。本試驗選用藏豬為研究對象，克隆藏豬IFN-λ3基因并分析其生物信息學(xué)，以期探索藏豬抗病力分子機制及其開發(fā)利用價值。本試驗擴增得到藏豬IFN-λ3基因，克隆測序鑒定后與Gen-Bank序列比對，其與野豬相似性最高為100%，與西方爪蟾相似性最低為43.1%。提示IFN-λ3基因在不同動物中具有同源性。

目前豬源Ⅰ和Ⅱ型IFN在動物疾病防治中的抗病毒機制研究較成熟，但I(xiàn)FN-λ相關(guān)研究較少，豬IFN-λ1對PRRSV、偽狂犬病病毒（PRV）、FMDV細(xì)胞增殖有抑制作用，且劑量依賴程度較高[10-11]。周恒等通過在細(xì)胞中加入不同濃度重組豬IFN-λ3，分析豬IFN-λ3原核表達(dá)及其活性，發(fā)現(xiàn)高濃度細(xì)胞孔出現(xiàn)細(xì)胞皺縮及死亡，低濃度細(xì)胞孔中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡，為干擾素臨床使用劑量研究提供理論依據(jù)[12]。

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3，將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）[13-14]，獲得高效表達(dá)藏豬IFN-λ3融合蛋白菌株[15]。選用MDBK/VSV系統(tǒng)，通過細(xì)胞病變抑制法測定豬IFN-λ3重組蛋白活性，發(fā)現(xiàn)高濃度蛋白造成細(xì)胞死亡。原因是原核表達(dá)產(chǎn)物某些成分有一定毒性，需在純化及透析過程中去除毒性成分，優(yōu)化臨床抗病毒活性使用劑量。研究可為研究豬Ⅲ型干擾素的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)，為臨床新藥物研發(fā)提供新方向。