VIGS誘導SL-ZH22基因沉默下番茄耐鹽性研究

李景富，張曉春，姜景彬，楊歡歡，趙婷婷，許向陽

（東北農業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

番茄生長受多種環(huán)境因素調控。溫度較低、土壤水分匱乏、土壤高鹽高堿等逆境影響番茄產量和品質。研究植物抗逆應答機制，明確植物基因調控機制，挖掘可供利用抗逆基因資源在農作物抗逆品種選育工作中具有重要意義。

VIGS（Virus-induced gene silencing）是高等植物轉錄后的一種基因沉默現象，當宿主細胞遇到外源病毒入侵與外源產生斥性時可引發(fā)[1]。RNA介導的基因沉默技術（RNA-mediated gene silencing）發(fā)生在RNA水平上，廣泛存在各類生物體中，該技術以核酸序列特異性降解機制為理論依據，在真菌中被稱為基因消除（Gene quelling），在植物中則被稱為轉錄后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing,PTGS）[2]。病毒誘導的基因沉默技術（VIGS）應用廣泛。目前，VIGS已應用于水稻、番茄、擬南芥等[3]。傳統(tǒng)鑒定植物基因功能方法涉及植物遺傳轉化和轉基因后代鑒定篩選，周期相對較長[4]。病毒誘導基因沉默技術（VIGS）相比于傳統(tǒng)基因功能分析方法，具有高效率、高通量等特點，在較大范圍基因功能鑒定分析中應用廣泛。此外，VIGS技術易于操作，沉默后可在短時間內觀察功能缺失表型[5]。近年來，在植物抗病抗逆、代謝調控等相關基因功能鑒定中，VIGS應用廣泛[6]。

在惡劣環(huán)境因素影響下，植株果實品質降低、產量減少。植物生長和發(fā)育過程中，ZF-HD轉錄因子家族基因在幫助調控植物應對復雜逆境脅迫時占據主導地位。ZF-HD家族基因在多種作物中進化、分類和功能研究較多，但與番茄ZF-HD轉錄因子相關功能研究相對較少，逆境脅迫方面研究更少。因此本試驗研究番茄ZF-HD家族基因中SL-ZH22基因功能及非生物脅迫下表達模式，確定該基因在番茄植株應對逆境脅迫中的作用。

通過VIGS技術可有效抑制特定基因表達，為明確植物特定基因控制的植物性狀，當目的基因表達受抑制時，根據植物表型變化確定該基因功能，為確定基因功能提供便捷高效方法。為研究SL-ZH22基因在番茄植株耐鹽性中的功能，本試驗從番茄植株中提取目的基因并作VIGS處理，驗證分析沉默基因耐鹽性功能。利用VIGS基因沉默原理，通過對比觀察植株表型變化、測定植株抗性相關生理生化指標，確定目的基因與植株抗性關系，進一步分析目的基因調控機制，為番茄抗逆品種選育研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料為番茄栽培品種Moneymaker，2018年1月種植于東北農業(yè)大學園藝試驗站連棟溫室中，播種時使用草炭蛭石混合物（3∶1），摹擬自然環(huán)境光溫。

1.2 方法

待Moneymaker長至四葉一心時，取18株長勢良好番茄幼苗，其中9株作基因沉默處理，其余為對照。用無菌水將四葉期番茄幼苗根部沖洗干凈，在裝有Hoagland's營養(yǎng)液的100 mL錐形瓶中預培養(yǎng)2 d，非生物脅迫處理沉默后番茄植株。分別在0、3、6、12、24 h觀察，對比植株表型變化。各時間點取樣，用于后續(xù)試驗分析。

1.2.1 目標片段擴增和載體構建

提取番茄葉片總RNA并合成cDNA。利用SLZH22基因mRNA序列，結合Primer5設計特異的含有雙酶切位點（Eco R I和Bam H I）及保護堿基的引物，瓊脂糖凝膠電泳分析得到PCR產物，PCR產物膠回收，回收產物測序驗證分析，PCR純化試劑盒（TaKaRa）純化，純化產物克隆到TRV2載體并測序。

從含TRV2菌液中提取質粒，利用Eco R I和Bam H I酶切TRV2質粒和目的片段，將酶切后質粒與目的片段經T4DNA連接酶連接，連接成功的載體命名為CM22。將CM22載體導入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，鑒定菌液PCR。并將含有CM22重組載體的大腸桿菌DH5α菌液與TRV2-PDS重組載體導入農桿菌中，命名為N22。八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS），是一種類胡蘿卜素合成關鍵酶，如果該基因在植株內被成功沉默，植株會出現白化現象。故本試驗將其作為指示基因，待接種TRV2-PDS載體植株葉片出現褪綠白化后，開展后續(xù)研究[7]。

1.2.2 番茄幼苗侵染方法

待Moneymaker番茄幼苗長至四葉一心時，移取長勢良好、尺寸相近番茄幼苗至營養(yǎng)缽中，用于后續(xù)農桿菌接種。

取1 mL注射器將混合菌液注射至番茄幼苗葉片與嫩莖中，每次接種均3次生物學重復。

按條件培養(yǎng)侵染番茄植株后，侵染17 d后番茄幼苗出現白化現象。從頂部生長點開始向底部逐漸擴散呈整體白化現象，番茄葉片由葉柄開始向葉脈擴散逐漸出現白化現象。2個月后白化現象仍顯著存在。證明指示基因PDS在番茄幼苗中沉默成功且效果穩(wěn)定。

1.2.3 基因沉默效率確定方法

分別從沉默處理25 d后植株和對照植株摘取葉片，提取RNA并合成cDNA，并作qRT-PCR確定基因沉默效率。

1.2.4 基因沉默植株非生物脅迫下表達量分析

綜合SL-ZH22基因表達模式對比效果與逆境處理效果，選擇高鹽脅迫開展后續(xù)試驗。待接種含TRV-PDS農桿菌的植株白化比較完全時，按時間點高鹽脅迫處理接種含重組質粒農桿菌植株并取樣，在樣品中提取RNA并合成cDNA，通過qRTPCR(實時熒光定量PCR)確定基因沉默效率。

1.3 生理生化指標測定

1.3.1 SOD、POD、PRO和MDA測定

本試驗所有生理生化指標測定均使用蘇州科銘生物技術有限公司生產試劑盒。生理生化指標測定前，預測定3個預期差異較大樣本。通過試驗測定后與預測一致，證明試劑盒與操作可信。

1.3.2 DAB與NBT植物組織染色

DAB與植物組織中H2O2反應生成棕紅色沉淀，NBT與植物組織中O2-反應生成深藍色沉淀[8]。根據該化學反應原理，通過DAB和NBT染色方法觀察番茄葉片H2O2和O2-積累情況，具體染色步驟參照文獻[9]。

1.4 數據分析

根據試驗結果利用Graph Pad6軟件處理數據并制作圖表。

2 結果與分析

2.1 農桿菌轉化侵染番茄植株侵染效果

侵染番茄植株并按條件培養(yǎng)，17 d后被侵染番茄幼苗逐漸白化，葉片白化現象由葉柄向葉脈擴散，整體白化現象從番茄頂部生長點開始向底部擴散，2個月后再次觀察，發(fā)現植株仍存在白化現象，證明指示基因PDS在番茄幼苗中沉默成功，且效果穩(wěn)定。將N22侵染過的番茄植株取材，分析表達量。

2.2 沉默效果初步驗證與分析

分別初步驗證正常植株、TRV2空載、SLZH22沉默后植株。結果顯示，正常植株和TRV2空載植株表達量無明顯變化，SL-ZH22表達量顯著降低，證明植株沉默成功。

2.3 沉默植株鹽脅迫表型觀察結果

因0、3、12、24 h時鹽脅迫下植株變化不明顯，6 h時最明顯，故將SL-ZH22基因沉默植株選取在6 h下觀察。由圖1可知，鹽脅迫處理6 h時，發(fā)現基因沉默后植株比對照植株萎蔫嚴重。

圖1 鹽處理下CK植株和SL-ZH22基因沉默植株表型變化Fig.1 Phenotype change of CK and SL-ZH22 gene silencing plants under salt stress

2.4 沉默前后番茄植株表達量對比結果

由圖2可知，在0、3、6、12 h時T2空載和未沉默植株SL-ZH22基因表達量無明顯變化，沉默處理后植株各時間點表達量均較低。

2.5 沉默前后非生物脅迫生理生化指標測定結果

2.5.1 超氧化物歧化酶SOD活性檢測結果

研究表明，高鹽脅迫下，番茄生理代謝中抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，高鹽逆境環(huán)境導致番茄植株中抗氧化酶SOD活性增強。

試驗結果如圖3所示。未沉默植株經鹽脅迫處理后SOD酶活性升高，SL-ZH22基因沉默后未脅迫植株SOD酶活性無明顯變化，高鹽脅迫后植株SOD酶活性降低，由此推測SL-ZH22基因可能參與SOD酶形成。

圖2 鹽處理下沉默SL-ZH22前后對比結果Fig.2 Comparison result before/after silencing SL-ZH22 under salt stress

圖3 逆境下沉默前后SOD酶活對比結果Fig.3 Comparison result of SOD enzyme activity before/after silencing under salt stress

2.5.2 過氧化物酶POD活性檢測結果

由圖4可知，基因沉默前鹽脅迫番茄植株POD酶活性高于對照，而沉默SL-ZH22基因后發(fā)現未脅迫處理植株POD酶活并無顯著變化，而鹽脅迫處理后POD酶活性低于對照植株。由此可推測SLZH22基因可能參與番茄植株POD酶形成。

2.5.3 脯氨酸PRO測定結果

由圖5可知，在SL-ZH22基因沉默前鹽脅迫處理番茄植株PRO表達率高于對照，SL-ZH22基因沉默后正常植株PRO表達率無明顯變化，鹽脅迫處理后植株PRO表達率顯著升高。

2.5.4 丙二醛MDA測定結果

由圖6可知，基因沉默前，鹽脅迫處理番茄植株MDA表達率高于對照。SL-ZH22基因沉默后未鹽脅迫處理番茄植株MDA表達率無顯著差異，脅迫處理后植株MDA表達率明顯低于對照。

圖4 逆境下沉默前后POD酶活對比結果Fig.4 Comparison result of POD enzyme activity before/after silencing under salt stress

圖5 逆境下沉默前后PRO對比結果Fig.5 Comparison result of PRO activity before/after silencing under salt stress

圖6 逆境下沉默前后MDA對比結果Fig.6 Comparison result of MDA content before/aftersilencing under salt stress

2.5.5 活性氧測定結果

由圖7、8可知，DAB染色后，未沉默前鹽脅迫處理植株葉片顏色比正常植株深，SL-ZH22基因沉默后，鹽脅迫處理后植株葉片基部染色相對較深。NBT試劑染色后，未脅迫處理基因沉默植株葉片與正常葉片相比顏色較深，基因沉默葉片在鹽脅迫下差別明顯，基因沉默處理葉片鹽脅迫下著色比正常葉片深。

圖7 DAB染色組Fig.7 DAB colored team

圖8 NBT染色組Fig.8 NBT colored team

3 討論與結論

本研究通過分析沉默SL-ZH22前后鹽脅迫處理基因表達量，結果表明基因沉默植株鹽脅迫處理后表達量差異顯著，初步明確SL-ZH22基因可能與番茄耐鹽性有關。植物體細胞內存在各種抗氧化物質，如抗氧化分子和抗氧化酶等，抗氧化物質通過直接或間接方式清除植物體內活性氧，避免細胞膜損傷，也可保護生物大分子，如蛋白質、核酸等免受自由基氧化損害。其在植物應對逆境脅迫，維持生長發(fā)育過程中有重要作用[10]。

植物遭遇逆境環(huán)境時，體內會積累大量活性氧（ROS），嚴重損傷植物機體。但植物體經過漫長進化后，可形成復雜的抗氧化酶體系減少植物體內ROS積累，抗氧化體系中不僅含維生素C（Vtiamin C）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等非酶類抗氧化物質，還包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）等酶類抗氧化劑[11]。在植物抗氧化系統(tǒng)中，SOD首先發(fā)揮作用，在氧化酶系統(tǒng)中處于核心位置。SOD在抗氧化體系中催化O2-·發(fā)生岐化反應，O2-·被分解成過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），抗壞血酸和過氧化氫酶又可將H2O2分解為H2O和O2，消除O2-·對細胞的氧化脅迫作用。該氧化酶在維持植物體自由基產生與消除的動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用[12]。但不同植物品種對逆境抵抗存在差異，SOD酶活性不同[13]。本試驗番茄品種Moneymaker在鹽脅迫條件下未沉默植株SOD酶活性明顯高于正常植株，沉默后未脅迫處理植株SOD酶活性無明顯變化，但高鹽脅迫處理植株SOD酶活性卻低于對照，推測SL-ZH22基因參與SOD酶形成；POD酶是膜保護系統(tǒng)重要組成部分，結合其他酶減少植物體內自由基及過氧化氫等造成的損害[14]。

本研究中正常番茄植株在逆境處理后POD酶活性比對照植株高，沉默SL-ZH22基因后，正常植株無明顯變化，鹽脅迫處理后植株POD酶活低于對照，說明植物抗鹽系統(tǒng)中SL-ZH22基因可能參與POD酶形成；PRO是植物中常見滲透物質，植物在脅迫條件下可在體內積累大量脯氨酸，調節(jié)細胞內滲透壓，保持胞內滲透平衡，有效避免滲透脅迫造成傷害，還有清理自由基作用，保護細胞結構，對植物抵抗逆境具有重要意義[15]。PRO在基因沉默前后有無鹽脅迫處理植株中均無顯著變化，而沉默SL-ZH22基因鹽脅迫處理后，植株中PRO含量增多，可證明SL-ZH22基因與植物抗逆系統(tǒng)中PRO形成無關；MDA是植物細胞在逆境環(huán)境中發(fā)生過氧化反應產物，常作為膜質過氧化指標[16]，本研究通過沉默SL-ZH22基因鹽脅迫處理后發(fā)現植株MDA活性低于對照，因此推測SL-ZH22基因與植物逆境脅迫中MDA產生無關。

番茄器官中葉片表面積最大，而氣孔與番茄水分控制與氣體交換密切相關，外部環(huán)境極易影響植株體氣孔閉合，改變植株形態(tài)和結構[17]。氣孔觀察結果顯示，番茄植株在鹽脅迫環(huán)境中部分氣孔處于關閉狀態(tài)，與齊紅巖番茄葉片氣孔在水分脅迫下易閉合結論一致[18]。本研究沉默SL-ZH22基因后植株在鹽脅迫下氣孔通度增大，證明SLZH22基因可能提高番茄耐鹽能力。植物細胞在有氧代謝過程中有活性氧（ROS）產生，ROS中包括很多含氧自由基和含氧分子，如超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）等含氧自由基；過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（O2-）等非自由基形成的含氧分子[19]。外界環(huán)境中逆境脅迫打破植物體中自由基產生與消除動態(tài)平衡，由此造成的活性氧積累會導致有害膜脂過氧化反應等，傷害植物[20]。本試驗檢測兩種重要ROS分別為過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2-）。使用二氨基聯苯胺（DAB）和氯化硝基四氮唑（NBT）檢測H2O2和O2-，DAB遇H2O2會產生淡紅棕色沉淀物質，NBT遇O2-產生深藍色不溶性甲醛化合物。沉默SL-ZH22基因植株葉片顏色較沉默前更深，沉默后鹽處理葉片顏色較沉默前更深，說明SL-ZH22基因減少番茄活性氧產生，證明SLZH22基因可增強番茄植株耐鹽能力。

本研究開展SL-ZH22基因VIGS功能驗證，通過植株沉默后表型觀察、基因表達量、組織學觀察及生理生化指標測定表明SL-ZH22基因沉默后番茄植株耐鹽能力明顯下降。因此，推測SLZH22基因可能提高番茄耐鹽能力。