聚乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱固相萃取-高效液相色譜法測定血清中卡馬西平和10-羥基卡馬西平

李 娜， 陳雪蕾， 張 磊， 張倩影， 安壯壯，孫 鑫， 王曼曼*， 徐厚君*

(1．華北理工大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山063210;2．華北理工大學附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

癲癇是一種由多種原因引起腦部神經(jīng)元突發(fā)性異常放電的慢性疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病的第二大頑癥［1］。癲癇需長期維持治療，但抗癲癇藥物有效血藥濃度范圍較窄，個體差異較大，較易發(fā)生藥物毒害事件［2］，因此，臨床上需要進行血藥濃度的監(jiān)測以實現(xiàn)個體化給藥并避免用藥惡性循環(huán)?？R西平(carbamazepine，CBZ)和奧卡西平是常見的抗癲癇藥物，前者以原型代謝，而后者在體內降解為有藥理活性的10-羥基卡馬西平(10-hydroxy carbamazepine，MHD)，因此，臨床上通過監(jiān)測CBZ和MHD的濃度對這兩種抗癲癇藥物進行量效評價［3］，其有效血藥濃度分別為 4～12 μg/mL和 15～35 μg/mL［4］。CBZ 和 MHD 的結構式見圖 1。

圖1 卡馬西平和10-羥基卡馬西平的結構式Fig．1 Chemical structures of carbamazepine(CBZ)and 10-hydroxy carbamazepine(MHD)

抗癲癇藥物血藥濃度的分析包括樣品前處理和儀器測定兩個環(huán)節(jié)，其中儀器測定主要利用色譜法［5－7］。有研究［8］表明，在色譜分析中，樣品前處理所消耗的時間最多，也是誤差的主要來源。因此，發(fā)展高效、簡易的樣品前處理方法具有重要意義。目前，血液樣品中CBZ和MHD的前處理方法主要有蛋白沉淀法(protein precipitation)、液液萃取法(liquid-liquid extraction，LLE)和基于 C18、親水-親脂平衡柱(hydrophilic-lipophilic balance sorbent，HLB)的固相萃取法(solid-phaseextraction，SPE)［9－12］。

有機聚合物整體柱材料作為一種常用的固相萃取吸附劑，目前已成功用于食品、藥品和環(huán)境等領域的前處理中［13－15］，它是由單體、交聯(lián)劑等混合物通過原位聚合制備而成的棒狀整體［16］。與傳統(tǒng)的填充型萃取柱相比，有機聚合物整體柱材料具有結構連續(xù)多孔、通透性好、柱壓低、傳質快等優(yōu)點。聚合物整體柱通常由單體提供可作用的功能基團，交聯(lián)劑提供骨架結構，二者共聚得到聚合物整體柱［17］。本實驗僅使用乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，在注射器柱管中構筑了一種聚EDMA整體柱，用于血清樣品中CBZ和MHD的富集、凈化，并結合高效液相色譜法，建立了簡單、高效的檢測癲癇患者血清中抗癲癇藥物的分析方法。

1 實驗部分

1．1 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD，美國Agilent公司);JEM-2800F聚焦離子束-電子束雙束電鏡(美國FEI儀器有限公司);ET-3301A氮吹濃縮儀(上海歐陸科儀有限公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

ProElut C18固相萃取柱(2 mL，北京迪馬歐泰科技發(fā)展公司);一次性無菌注射器(2 mL，山東威高集團醫(yī)用高分子有限公司)。EDMA(純度98%)和乙酸乙酯(ethyl acetate，色譜純)(上海阿拉丁試劑公司);甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司);N，N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇400、1，4-丁二醇和偶氮二異丁腈、丙酮、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、乙酸銨(CH3COONH4)純度均＞99%，均購自國內公司。

CBZ(純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院);MHD(純度98%，北京迪馬歐泰科技發(fā)展公司)。用MeOH配制質量濃度為 100 μg/mL的 CBZ和MHD標準儲備液，分別于4℃和－20℃下保存。

1．2 聚EDMA整體柱的制備

準確量取 650 μL EDMA，移至含有 1 700 μL N，N-二甲基甲酰胺、755 μL 1，4-丁二醇和 220 μL聚乙二醇400的混合溶液中，再加入10 mg偶氮二異丁腈，于室溫下超聲混合均勻。取500 μL混勻后的溶液灌入2 mL注射器空柱管中，兩端密封，于65℃水浴反應25 h。反應完成后，用MeOH沖洗該柱，得到聚EDMA整體柱，待用。

1．3 血清樣品的采集和制備

采集河北省某醫(yī)院服用卡馬西平或奧卡西平癲癇病患者血液樣品各4例，在患者維持服藥劑量達到穩(wěn)態(tài)(通常連續(xù)服藥時間≥2～3周)后，于晨起服藥前采集肘靜脈血4.0 mL，靜置 30 min后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，待測。健康志愿者血液樣品作為空白對照樣品，采集和處理方法同上。本實驗經(jīng)華北理工大學醫(yī)學倫理委員會批準。

1．4 固相萃取血清中CBZ和MHD

使用ACN和純水各1 mL對聚EDMA整體柱平衡，上樣稀釋后的血清樣品2 mL(加入等體積的純水稀釋)，加壓使樣品以1 mL/min的流速流出，然后使用2 mL CH3COONH4淋洗以除去吸附在固相萃取柱上的雜質。最后，使用2 mL MeOH對CBZ和MHD進行洗脫，收集流出液，于25℃、48 kPa條件下氮吹濃縮，用MeOH定容至0.2 mL，待測。

1．5 色譜分離條件

色譜柱為Agilent EC-C18柱(150 mm×4.6 mm，4 μm，美國Agilent公司);柱溫為25℃;流動相為(A)純水和(B)MeOH;流速為1 mL/min。梯度洗脫程序為 0～4.0 min，50%B;4.0～8.0 min，50%B～55%B。進樣量為10 μL;檢測波長為220 nm。

2 結果與討論

有機聚合物整體柱通常是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑原位聚合而成。傳統(tǒng)的整體柱，采用單體提供功能基團，交聯(lián)劑提供骨架，本研究僅使用EDMA構筑固相萃取吸附劑，以期得到一種制備簡單、吸附性能良好的吸附劑材料。

CBZ和MHD是弱極性化合物，常用C18、HLB固相萃取柱進行前處理，而聚EDMA整體柱表面具有典型的弱極性基團［17］，因此可用于血液中CBZ和MHD的富集和凈化。

2．1 聚EDMA整體柱的表征

圖2為聚EDMA整體柱橫截面掃描電子顯微鏡圖，可以看出，聚EDMA整體柱孔結構均勻，通透性良好，適宜作為固相萃取吸附劑。

圖2 聚EDMA整體柱掃描電子顯微鏡圖(放大倍數(shù)5000)Fig．2 Scanning electron microscopy image of poly EDMA monolithic column(magnification of 5000)EDMA:ethylene glycol dimethacrylate．

2．2 聚EDMA整體柱制備條件的優(yōu)化

在聚合物整體柱的制備過程中，聚合度受聚合時間和溫度的影響，聚合度過大會導致整體柱表面裸露的顆粒變少、孔徑變小以及比表面積減小，導致壓力增高［17］，從而影響整體柱的萃取性能。因此實驗考察了反應時間(20、25和30 h)和反應溫度(60、65和70℃)對整體柱萃取性能的影響。

實驗固定反應溫度為65℃，考察反應時間為20、25和30 h時，聚EDMA整體柱對CBZ和MHD萃取性能的影響(見圖3a)。當反應時間由20 h增加至25 h時，萃取效率隨聚合時間的延長而增加，繼續(xù)增加反應時間至30 h，其萃取效率降低。

固定反應時間為25 h，比較反應溫度(60、65和70℃)對整體柱萃取效率的影響(見圖3b)。當反應溫度為65℃時，整體柱對兩種目標物的萃取性能最佳。因此本實驗選擇反應溫度65℃、反應時間25 h的制備條件。

2．3 聚EDMA整體柱固相萃取條件的優(yōu)化

固相萃取的淋洗和洗脫環(huán)節(jié)決定了方法的準確度，因此實驗考察了淋洗溶液種類、洗脫溶液種類和體積對目標物萃取效率的影響。

2．3．1 淋洗溶液種類

淋洗步驟是最大限度地淋洗雜質而仍將目標物保留在固相萃取柱上的步驟。由于血液樣品的主要雜質為蛋白質和脂肪，同時考慮到聚EDMA整體柱與待測物的弱極性作用，實驗考察了不同淋洗溶液(25 mmol/L NaH2PO4、25 mmol/L CH3COONH4和MeOH-H2O(2∶8，v/v))對目標物萃取效率的影響(見圖4a)。實驗對2 mL含2 μg/mL CBZ和4 μg/mL MHD的加標血清樣品進行固相萃取。結果表明，當25 mmol/L CH3COONH4作為淋洗溶液時，淋洗效果較好，CBZ和MHD的回收率最佳。

2．3．2 洗脫溶液的種類和體積

綜合考慮洗脫溶液的極性、毒性及目標物的溶解度等因素的影響，對2 mL含2 μg/mL CBZ和4 μg/mL MHD的加標血清樣品進行固相萃取，考察MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯4種洗脫溶液對CBZ和MHD的洗脫效果(見圖4b)。結果表明，MeOH的洗脫效果最佳。為了節(jié)約溶劑，同時避免洗脫溶液過多而引起的誤差，實驗考察了不同洗脫體積(1、2和3 mL)對萃取效率的影響(見圖4c)。結果表明，當洗脫體積從1 mL增加至2 mL時，洗脫效率增加;繼續(xù)增加至3 mL時，目標物回收率降低，同時氮吹處理的時間延長。因此實驗最終選擇2 mL MeOH進行洗脫。

圖4 (a)淋洗溶液種類、(b)洗脫溶液種類和(c)洗脫溶液體積對CBZ和MHD回收率的影響(n=3)Fig．4 Effects of(a)type of washing solvent，(b)type of elution solution and(c)elution volume on the recoveries of CBZ and MHD(n=3)

2．4 聚EDMA整體柱的富集凈化效果

在最優(yōu)條件下，對加標 2 μg/mL CBZ和 4 μg/mL MHD的健康人血清樣品直接進樣，和經(jīng)聚EDMA整體柱固相萃取以及商品化C18固相萃取柱萃取后進行分析和對比(見圖5)。結果表明，直接進樣，CBZ和MHD色譜峰響應較低，且雜質峰明顯(見圖5a);經(jīng)聚EDMA整體柱固相萃取后，CBZ和MHD得到明顯富集，且雜質峰的干擾顯著降低(見圖5b)，并與商品化C18固相萃取柱的富集、凈化效果相當(見圖5c)。

2．5 方法驗證

2．5．1 線性范圍、檢出限與定量限

對 0.02～40 μg/mL CBZ 和 0.05～100 μg/mL MHD標準溶液進行測定(n=3)，以質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線。如表1所示，CBZ和MHD在各自的范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(r)均為0.999。

對加標空白血清樣品進行分析，以3倍和10倍信噪比(S/N)確定CBZ和MHD的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結果表明，CBZ和MHD的LOD分別為0.004 μg/mL 和0.01 μg/mL，LOQ 分別為0.014 μg/mL 和 0.04 μg/mL。

2．5．2 回收率和精密度

對空白血清樣品進行3個水平的加標回收試驗，每個加標水平平行測定3次。結果表明，CBZ和MHD的平均回收率為92.7%和94.2%，日內精密度和日間精密度分別為1.3%～3.2%和1.5%～6.1%。說明該方法準確度和精密度均較高，滿足分析要求。

2．5．3 聚EDMA整體柱的重復性和穩(wěn)定性

采用相同批次(n=3)和不同批次(n=5)制備的聚 EDMA整體柱對加標 2 μg/mL CBZ和 4 μg/mL MHD的健康人血清樣品進行固相萃取，以CBZ和MHD的色譜峰面積計算相同批次和不同批次的RSD，分別為1.8%～4.1%和2.9%～5.3%。同一固相萃取柱重復使用8次，CBZ和MHD色譜峰面積的RSD≤5.8%。上述結果表明該整體柱具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

圖5 加標空白血清樣品經(jīng)(a)直接進樣、(b)聚EDMA整體柱和(c)商品化C18固相萃取柱萃取后的色譜圖Fig．5 Chromatograms of blank serum samples with(a)direct injection，and solid phase extraction by(b)the poly EDMA monolithic column and(c)the commercial C18column The samples were spiked with 2 μg/mL CBZ and 4 μg/mL MHD．

表1 CBZ和MHD的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及其相對標準偏差Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)，recoveries and their relative standard deviations(RSDs)of CBZ and MHD

2．6 實際樣品分析

為進一步驗證方法的可行性，使用聚EDMA整體柱，結合高效液相色譜法測定服用CBZ和奧卡西平的癲癇患者的血清樣品各4例，結果見表2。在4例服用卡馬西平的癲癇患者的血清樣品中均檢測出CBZ，含量為 0.38±0.02～10.02±0.01 μg/mL;在 4例服用奧卡西平的癲癇患者血清樣品中均檢測出MHD，含量為 0.67±0.01～19.43±0.04 μg/mL。為進一步說明結果的準確性，對8份癲癇患者血清樣品進行加標回收試驗，平均加標回收率為85.7%～95.2%，表明結果準確，具有可信度。

2．7 與文獻方法比對

將本方法與常用的前處理方法，如蛋白質沉淀法、液液萃取法、基于C18或HLB萃取柱的固相萃取法進行比較(見表3)。結果表明，本方法得到的回收率與文獻報道方法相當，另外該方法能夠有效富集目標物，檢出限優(yōu)于文獻方法，滿足臨床血清中CBZ和MHD的分析要求。

表2 癲癇患者血清樣品中CBZ和MHD的含量Table 2 Contents of CBZ and MHD in epileptic patient serum samples

表3 本方法與其他方法的比較Table 3 Comparison of the present method with other methods

3 結論

本研究僅使用EDMA在注射器中構筑固相萃取整體柱，并結合高效液相色譜法，將其成功應用于癲癇患者血清樣品中CBZ和MHD的分析。該整體柱制備簡單，重復性和穩(wěn)定性良好，且具有一定的重復使用能力，可節(jié)約成本。該法簡單、高效，滿足臨床上血清中CBZ和MHD的分析要求，為血藥濃度的檢測提供了新方法。