高效液相色譜法同時測定水體中氧氟沙星及其手性異構體

仲小飛， 秦曉鵬， 杜 平， 陳 娟， 張云慧， 何 贏， 劉 菲

(1．環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，土壤與固體廢物研究所，中國環(huán)境科學研究院，北京100012;2．水資源與環(huán)境工程北京市重點實驗室，中國地質大學(北京)，北京100083)

抗生素是一大類用于治療細菌感染的藥物，廣泛應用于臨床醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖中。據(jù)統(tǒng)計，全球每年抗生素的使用量在10～20萬噸［1］，而根據(jù)Zhang等［2］的調查顯示我國每年抗生素的使用量達到了9.57萬噸。氧氟沙星(ofloxacin，OFL)作為第二代氟喹諾酮類抗生素因具有廣譜抗菌性、最低抑菌濃度、低毒等優(yōu)勢被廣泛應用［3］。氧氟沙星的手性異構體 S-(－)-氧氟沙星(levofloxacin，LEV，左氧氟沙星)為第三代氟喹諾酮類抗生素，被證明是R-(+)氧氟沙星抗菌性的8～128倍［4］，且消除半衰期比氧氟沙星短［5］。工業(yè)上難以將兩者分離，因此在臨床應用的氧氟沙星中常含有大量的左氧氟沙星?？股卦诒皇褂煤?，大部分都會以原形排出體外，因此氧氟沙星或其手性異構體在環(huán)境中被頻繁檢出［6－9］。環(huán)境中大量的抗生素不僅對人體產(chǎn)生不良影響［10］，還會影響生物群落，破壞生態(tài)平衡［11］。

目前比較常用的測定抗生素的方法是超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)［12－15］，一般可以同時檢測幾十種抗生素，但是該方法無法區(qū)分氧氟沙星和左氧氟沙星［16］。氧氟沙星進入地下水中后的活性成分主要是左氧氟沙星［17］。因此，為了準確定量氧氟沙星及其手性異構體和評價其在地下水中的環(huán)境風險，需建立一種能同時將兩種抗生素分離檢測的方法。氧氟沙星及其手性異構體的檢測方法主要有毛細管電泳法(CE)［18，19］、流體注射化學發(fā)光法(CL)［20］、手性配體交換色譜法［21－24］和高效液相色譜-手性色譜柱法［25，26］等。毛細管電泳法測試時間短，但制備能力差;流體注射化學發(fā)光法雖然精確迅速，但操作步驟復雜，成本高;HPLC-手性色譜柱法因手性柱的制作復雜、費用高且只能拆分一對或幾對異構體而有所限制;手性配體交換色譜法利用C18柱手動添加手性流動相被認為是對氧氟沙星及其手性異構體分離最有效和最常用的方法［21，27］，常見的配體主要包括 L-(－)-對甲基二苯甲酰酒石酸(L-DTTA)和L-(－)-二苯甲酰酒石酸(LDBTA)或者Cu2+和N-n-十二烷基-L-脯氨酸手性配體等［28，29］。手性流動相是含有一定濃度的氨基酸和CuSO4的混合溶液。配位交換高效液相色譜的原理是手性流動相中的Cu2+與氨基酸絡合形成的二元配體再與氧氟沙星及其手性異構體絡合形成具有手性差異的三元配體，在分離柱中具有不同的保留時間，從而將兩種抗生素分離［30］。

盡管已有研究針對氧氟沙星及其手性異構體的分離，但是鮮少有研究環(huán)境中陰陽離子對測試影響的報道［21，22，31］。地下水等水體中的陽離子或溶解性有機物會與氧氟沙星發(fā)生絡合作用［32，33］，可能會對抗生素的測試產(chǎn)生影響。因此本文除了對氨基酸的種類、甲醇濃度、柱溫、流動相pH值等參數(shù)進行優(yōu)化外，還研究了地下水中常見陽離子以及腐殖酸(HA)對氧氟沙星及其手性異構體分離測試的影響。

1 實驗部分

1．1 儀器、試劑與材料

LC-20AT高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司);Milli-Q超純水制備器(美國Millipore公司)。

氧氟沙星及其手性異構體和左氧氟沙星(純度＞98.0%)購自美國Sigma公司;氧氟沙星購自美國藥典協(xié)會;異亮氨酸(L-isoleucine)、亮氨酸(leucine)、賴氨酸(valine)、纈氨酸(lysine)與無水硫酸銅(分析純)均購自北京國藥公司;甲醇(色譜純)購自美國Baker公司;腐殖酸(主要為黃腐酸，純度＞90%)購自上海阿拉丁試劑有限公司。地表水樣品采自中國環(huán)境科學研究院(北京)，用SW表示;地下水樣品分別采自貴州省貴陽市鎮(zhèn)寧縣和關嶺縣，用GW1和GW2表示。所有水樣測試前均經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾。

1．2 分析條件

分析柱為 C18柱(25 cm×0.46 cm，5 μm，美國Agilent公司);流動相為20%(v/v)甲醇水溶液(含4 mmol/L異亮氨酸(配體)和3 mmol/L CuSO4，pH 4.5);流速為1.0 mL/min;檢測器為SPD-M20A二極管陣列檢測器;檢測波長為293 nm;進樣體積為 20 μL。

2 結果與討論

2．1 氧氟沙星及其手性異構體分離方法的優(yōu)化

2．1．1 氨基酸種類的影響

選用4種氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和賴氨酸)作為配位交換色譜中的配體，研究不同種類的氨基酸對氧氟沙星及其手性異構體分離效果的影響。其中，4種氨基酸和CuSO4的濃度分別為5 mmol/L和4 mmol/L，流動相中甲醇的體積分數(shù)為12%，柱溫為40℃，流速為1.0 mL/min。由表1可知，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸作為流動相配體時出峰時間略有差異，而賴氨酸作為配體時，在60 min內未見氧氟沙星及其手性異構體的色譜峰。

表1 采用不同氨基酸作為配體時氧氟沙星和左氧氟沙星的保留時間(tS、tR)、分離度(R)和手性拆分因子(α)Table 1 Retention times(tS，tR)，resolutions(R)and chiral separation factor(α)of ofloxacin and levofloxacin usingdifferentamino acidsas ligands

可以看出，當纈氨酸作為配體時，氧氟沙星和左氧氟沙星的出峰時間相對較早，這是由于這對手性異構體的出峰時間受氧氟沙星/左氧氟沙星-銅-氨基酸(OFL/LEV-Cu-A)絡合物分子結構和相對分子質量的影響。纈氨酸的相對分子質量最小，因此出峰時間相對最早。氧氟沙星和左氧氟沙星的分離度取決于OFL/LEV-Cu-A絡合物分子結構及其在色譜柱中遷移速率的差異。異亮氨酸為配體時分離度最高，為1.58，而亮氨酸和纈氨酸為配體時分離度依次減小。氨基酸具有手性分離的條件是需要一個空間結構的側鏈以及特定的親脂性［27］，與氧氟沙星及其手性異構體的親和性不同，從而引起分離度有差異，而賴氨酸只有一個直鏈，并不具備手性選擇性，因此本實驗選擇異亮氨酸作為配位交換色譜的配體。Bi等［22］研究發(fā)現(xiàn)，當異亮氨酸和CuSO4的濃度分別為4 mmol/L和3 mmol/L時，兩種抗生素的分離度為1.63，因此后續(xù)實驗的流動相中異亮氨酸和CuSO4的濃度分別采用4 mmol/L和3 mmol/L。

2．1．2 流動相中甲醇體積分數(shù)的影響

實驗研究了流動相中甲醇的體積分數(shù)(14%～20%)對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響(見圖1)。結果表明，氧氟沙星和左氧氟沙星的tS、tR、α和R均隨著甲醇體積分數(shù)的升高呈下降趨勢。原因可能是甲醇的體積分數(shù)較高會使流動相中的電解質(氨基酸)生成沉淀［22，30］，引起氨基酸、銅離子和抗生素三元配體發(fā)生變化，同時甲醇體積分數(shù)越高，洗脫能力越強，出峰時間變快，氧氟沙星及其手性異構體的α和R有所降低。雖然甲醇體積分數(shù)較低時，氧氟沙星及其手性異構體的R和α均較大，但是保留時間較長，而且影響氧氟沙星及其手性異構體的峰形，導致拖尾嚴重，且實驗結果顯示，在高比例的甲醇條件下，氧氟沙星及其手性異構體的響應值更高，更利于準確定量。同時有較多研究［21，22，31］結果顯示，甲醇體積分數(shù)超過20%時，氧氟沙星及其手性異構體的R相對偏低。因此本實驗選擇甲醇體積分數(shù)為20%進行后續(xù)實驗。

圖1 甲醇體積分數(shù)對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響Fig．1 Effect of volume percentage of methanol on the separation of ofloxacin enantiomers

2．1．3 流動相pH值的影響

流動相的pH值是影響分離度的一個重要因素，研究［21，30］表明分離度隨著流動相 pH 值的增加而增加，但是Yan等［30］指出流動相pH值大于5.0時易形成Cu2+沉淀。因此本文考察了不同pH值(3.2～4.5)對手性分離的影響(見圖2)。結果表明，氧氟沙星及其手性異構體的α和R隨著流動相pH值的增加而增加。原因可能是隨著流動相pH值的增加，溶液中氫離子濃度逐漸降低，氨基酸與氧氟沙星及其手性異構體之間的氫鍵作用降低，而與Cu2+離子形成的絡合物趨于穩(wěn)定［22］。流動相pH值為4.5時分離度達到2.7，且氧氟沙星及其手性異構體的峰面積較高，保留時間可以接受。因此本實驗將流動相的pH值設為4.5。

圖2 流動相pH值對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響Fig．2 Effect of pH value of mobile phase on the separation of ofloxacin enantiomers

2．1．4 柱溫的影響

實驗比較了不同柱溫(25、30、35、40℃)對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響(見圖3)。結果表明，氧氟沙星及其手性異構體的tS、tR和R隨著溫度的增加而降低，α無明顯變化。

圖3 柱溫對氧氟沙星手性分離的影響Fig．3 Effect of column temperature on the separation of ofloxacin enantiomers

隨著柱溫的升高，LEV/OFL-Cu-A三元配體在C18柱上穩(wěn)定性降低，導致停留時間減少，因此保留時間隨柱溫的升高而降低［22，30］，而分離度也隨之減小，但均能達到基線分離，氧氟沙星及其手性異構體的α無明顯變化。通過實驗可知，柱溫對氧氟沙星及其手性異構體的峰形和峰面積影響不大，不會影響最終的測試結果，但是柱溫一般不建議超過40℃，會影響待測物的穩(wěn)定性。因此本實驗選擇柱溫40℃作為后續(xù)的實驗條件。

2．2 地下水中的其他因素對分離的影響

2．2．1 金屬陽離子的影響

為研究地下水中金屬陽離子對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響，實驗分別對添加了4種地下水中常見金屬陽離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+)的氧氟沙星與其手性異構體溶液進行分析，并與空白氧氟沙星與其手性異構體溶液進行比較。Ca2+、Mg2+、Fe3+和Zn2+的添加水平參考《地下水質量標準》(GB/T 14848-2017)標準，分別為 500、450、0.3 和 1 mg/L，氧氟沙星及其手性異構體的初始質量濃度分別為27.18 mg/L和22.78 mg/L。結果表明，添加了 Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+后，氧氟沙星及其手性異構體的分離度分別為2.67、2.66、2.69和2.66，與未添加時的2.70相比無明顯變化，可以確定常見陽離子對氧氟沙星及其手性異構體的分離沒有明顯影響，但是氧氟沙星及其手性異構體的峰面積均有不同程度的降低(見圖4)，其中添加Fe3+時降幅最大。原因可能是4種金屬離子都與氧氟沙星及其手性異構體絡合［32］，與Cu2+競爭絡合，導致氧氟沙星及其手性異構體的紫外吸光度降低。由于4種陽離子與氧氟沙星及手性異構體的絡合常數(shù)不同，如表2所示，F(xiàn)e3+的絡合常數(shù)明顯高于Cu2+，并且會與表面羥基發(fā)生絡合［33］，因此對測試結果影響最大;其余3種離子影響較小，并且Zn2+的濃度較低，所以影響最不明顯。同一金屬離子對氧氟沙星和左氧氟沙星兩種抗生素的影響也與其之間的絡合常數(shù)呈正相關。

圖4 不同金屬陽離子對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響Fig．4 Effect of different metal cations on the separation of ofloxacin enantiomersLEV:levofloxacin;OFL:ofloxacin．

表2 金屬陽離子與氧氟沙星及其手性異構體的絡合物常數(shù)Table 2 Constants of ofloxacin enantiomers complex with metal cations

2．2．2 腐殖酸的影響

腐殖酸是地下水中常見的溶解性有機物，實驗考察了腐殖酸含量對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響(見表3)。可以看出，腐殖酸含量對氧氟沙星及其手性異構體的手性分離影響不明顯，但是含量越高氧氟沙星及其手性異構體的峰面積和檢測濃度越低。原因可能是腐殖酸與氧氟沙星及其手性異構體發(fā)生絡合［34，35］，導致吸附在腐殖酸上的部分氧氟沙星或左氧氟沙星不能被色譜柱識別，從而未被檢測出來;或者是腐殖酸與Cu2+絡合［36］，占據(jù)了氧氟沙星及其手性異構體的絡合位點，導致未絡合的抗生素不能被檢測出來。

表3 腐殖酸含量對氧氟沙星及其手性異構體分離的影響Table 3 Effect of content of humic acid(HA)on the separation of ofloxacin enantiomers

2．3 方法學考察

2．3．1 標準曲線

對0.5～50 mg/L氧氟沙星和左氧氟沙星進行分析，以目標物的峰面積為縱坐標(y)、對應的質量濃度為橫坐標(x，mg/L)繪制標準曲線。結果顯示，氧氟沙星和左氧氟沙星在0.5～50 mg/L范圍內具有良好的線性相關，線性相關方程分別為y=106 819x和 y=96 533 x，相關系數(shù)(r2)分別為0.999 4和0.999 3。在不連續(xù)的3天中對添加了3～5倍儀器檢出限水平的空白加標樣品進行分析(n=7)，然后再用n=7的置信度乘以7個數(shù)據(jù)的標準偏差，最終得出氧氟沙星和左氧氟沙星的方法檢出限分別為0.047 mg/L和0.040 mg/L。

2．3．2 準確度與精密度

在一天和不連續(xù)的3天中對含50 mg/L的氧氟沙星和左氧氟沙星混合標準溶液進行測定(n=3)。結果顯示，氧氟沙星和左氧氟沙星的日內標準偏差為0.9%和1.6%，日間標準偏差為0.7%和1.1%。

對實際水樣進行分析，結果顯示，均未檢測出氧氟沙星及其手性異構體。對SW、GW1、GW23個水樣進行5 mg/L和40 mg/L的加標回收試驗，結果如表4所示，氧氟沙星和左氧氟沙星在5 mg/L和40 mg/L加標水平下的回收率分別為95.6%～99.1%、95.4%～97.4%和102.2%～119.8%、91.8%～101.1%，所有樣品的加標回收率均在合理范圍內。

表4 不同加標水平下氧氟沙星和左氧氟沙星的回收率Table 4 Recoveries of OFL and LEV at the different spiked levels

3 結論

建立了配位高效液相色譜分離測定氧氟沙星及其手性異構體的方法，研究了地下水中常見陽離子與腐殖酸對氧氟沙星及其手性異構體分離測定的影響。后期實驗也將建立氧氟沙星及其手性異構體的定量方法，深化研究如何降低方法的檢出限，同時研究腐殖酸的影響機理，為研究腐殖酸影響地下水中抗生素的遷移原理打下基礎。