硫熏及不同硫熏程度對(duì)白術(shù)化學(xué)成分的影響△

徐春良，付輝政，趙雯，戴冕，任琦*，鐘瑞建*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.江西江中中藥飲片有限公司，江西 九江 332300；3.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院／江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029）

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎之功效。用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動(dòng)不安[1-4]。白術(shù)始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，是常用大宗藥材，俗有 “南術(shù)北參、十方九術(shù)”之說(shuō)，為健脾補(bǔ)氣第一要藥，廣泛應(yīng)用于臨床[5]。白術(shù)含有較多揮發(fā)性成分、內(nèi)酯類成分、苷類及多糖類成分[6-7]，儲(chǔ)存不當(dāng)容易發(fā)生 “走油變色”，且影響其外觀和質(zhì)量。白術(shù)在產(chǎn)地加工中，常采用硫磺熏蒸的方法進(jìn)行干燥，經(jīng)硫磺熏蒸后白術(shù)外觀性狀更加美觀不易變色且更易保存[8]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定白術(shù)藥材及飲片中二氧化硫殘留量不得大于 400 mg·kg－1[1]，筆者在2017年白術(shù)國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分白術(shù)飲片二氧化硫殘留量超過(guò)規(guī)定限度1倍以上。硫熏不僅影響中藥藥效及安全性，還可能會(huì)破壞藥材化學(xué)成分[9-11]。目前未見(jiàn)不同硫磺熏蒸程度對(duì)白術(shù)化學(xué)成分的影響研究。本實(shí)驗(yàn)首先采用薄層色譜法篩查硫熏對(duì)白術(shù)化學(xué)成分的變化，通過(guò)硅膠柱色譜分離制備和波譜技術(shù)分析確證發(fā)生變化的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，其次采用離子色譜法和高效液相色譜法考察不同硫磺熏蒸程度白術(shù)與發(fā)生變化化學(xué)成分的相關(guān)性，為白術(shù)飲片的科學(xué)炮制、合理應(yīng)用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher ScientificICS-1600離子色譜儀、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、陰離子交換柱；CAMAG TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)；Waters Xevo G2QTOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；SHIMADAU LC-20AD高效液相色譜儀，四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PAD檢測(cè)器、LC solution工作站；Sartorius BT 25 S十萬(wàn)分之一電子天平。

1.2 試藥

東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110768-200504，供含量測(cè)定用）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，其他試劑均為分析純。

白術(shù)（批號(hào)：20160901、170110、170209）購(gòu)于浙江磐安藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院付輝政副研究員鑒定為菊科植物白術(shù) Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫磺熏蒸白術(shù)的制備

取白術(shù)飲片，采用有機(jī)玻璃材料自制熏箱進(jìn)行硫磺熏蒸。熏箱內(nèi)設(shè)一層網(wǎng)狀隔板，將200 g白術(shù)飲片均勻擺放在隔板上，將定量硫磺（0.5、1、2、3 g）置于坩堝內(nèi)并點(diǎn)燃形成藍(lán)色火焰時(shí)放置于熏箱底部，熏至24 h后將白術(shù)飲片放置于恒溫干燥箱80℃干燥。

2.2 硫磺熏蒸對(duì)白術(shù)化學(xué)成分的影響

2.2.1 薄層色譜定性篩選 取同一批硫熏與未硫熏白術(shù)樣品粉末各4 g，加甲醇20 mL，超聲處理45 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。吸取上述供試品溶液20μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（19∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 白術(shù)樣品中香豆素類成分薄層色譜圖

由圖1可知，白術(shù)經(jīng)硫熏后，斑點(diǎn)1和2含量明顯下降，說(shuō)明硫熏會(huì)對(duì)白術(shù)化學(xué)成分產(chǎn)生影響。取不同批次的樣品3批，同法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致。為明確斑點(diǎn)1和2的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對(duì)斑點(diǎn)1和2進(jìn)行了制備及結(jié)構(gòu)確證。

2.2.2 目標(biāo)產(chǎn)物的制備 取白術(shù)（2.5 kg），粉碎，用10倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h。提取液濃縮至適量，用乙酸乙酯萃取4次，萃取液減壓濃縮至干，得乙酸乙酯部分（105 g）。將乙酸乙酯部分與硅膠拌樣，經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-丙酮（50∶1～10∶1）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢視，合并相近的組分，得 10個(gè)組分（Fr.1～Fr.10）。Fr.6（8.6 g）以三氯甲烷-丙酮（15∶1）等度洗脫，得到目標(biāo)產(chǎn)物1（斑點(diǎn)1）和2（斑點(diǎn)2）。

2.2.3 目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定 目標(biāo)產(chǎn)物1：淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS m／z：193[M＋H]＋，191[M-H]－。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.83（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），7.08（1H，s，H-8），6.71（1H，s，H-5），6.18（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3），4.88（1H，s，-OH），3.88（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：164.1（C-2），112.5（C-3），146.2（C-4），109.3（C-5），146.8（C-6），153.3（C-7），103.6（C-8），151.6（C-9），112.3（C-10），56.8（OCH3）。綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致[12]，鑒定為東莨菪內(nèi)酯。

目標(biāo)產(chǎn)物2：白色針狀結(jié)晶（甲醇）。ESI-MS m／z：163[M＋H]＋，161[M-H]－。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.81（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），7.41（1H，d，J＝8.5 Hz，H-5），6.16（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3），6.75（1H，dd，J＝8.5，2.2 Hz，H-6），6.70（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：163.5（C-2），113.8（C-3），146.1（C-4），130.4（C-5），113.2（C-6），161.9（C-7），103.3（C-8），157.8（C-9），112.1（C-10）。綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致[13]，鑒定為傘形花內(nèi)酯。

3 不同劑量硫磺熏蒸對(duì)白術(shù)中東莨菪內(nèi)酯的影響

3.1 東莨菪內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定

3.1.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-SPC18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（8∶92），檢測(cè)波長(zhǎng)為344 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。在上述色譜條件下，東莨菪內(nèi)酯分離情況及峰形良好。色譜圖見(jiàn)圖2。

3.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含4μg的溶液，即得。

3.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.1.4 線性關(guān)系考察 精密稱取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品10.26 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液。吸取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液，加甲醇分別稀釋至質(zhì)量濃度為1.026、2.052、4.104、6.146、8.208μg·mL－1，分別吸取20μL按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝3.693 1×106X－3.074 0×103（r＝0.999 9），東莨菪內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.020 5～0.164 2μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取按3.1.2制備的對(duì)照品溶液20μL，按3.1.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD＝0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖2 白術(shù)及對(duì)照品HPLC圖

3.1.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：170110）6份，每份約4 g，精密稱定，按3.1.3制備供試品溶液，按3.1.1色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，東莨菪內(nèi)酯含量的平均值為13.601 2 mg·kg－1，RSD＝1.7%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（批號(hào)：170110）20μL，分別于 0、5、10、15、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD＝1.6%（n＝6），說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率法，精密稱取已知含量（批號(hào)：170110）的樣品 6份，每份約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份精密加入含東莨菪內(nèi)酯1.351 0μg·mL－1對(duì)照品溶液20 mL，按3.1.3制備供試品溶液，按3.1.1色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果東莨菪內(nèi)酯的平均回收率為100.6%（n＝6），RSD＝0.7%。見(jiàn)表1。

表1 白術(shù)中東莨菪內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.1.9 耐用性試驗(yàn) 取樣品按3.1.3制備供試品溶液，分別用 Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）和Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5μm）3種品牌的色譜柱按3.1.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差別。

3.1.10 樣品測(cè)定 取白術(shù)樣品15批，每個(gè)樣品取3份，按3.1.3制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液20μL，按3.1.1色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出東莨菪內(nèi)酯的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白術(shù)中二氧化硫殘留量及東莨菪內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3.2 二氧化硫殘留量測(cè)定

3.2.1 色譜條件 陰離子交換柱（AS11-HC，250 mm×4 mm），淋洗液為20 mmol·L－1氫氧化鉀溶液，抑制電流為 50 mA，流速為 1.0 mL·min－1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為25μL[14-15]。二氧化硫殘留量測(cè)定離子色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 白術(shù)中二氧化硫殘留量測(cè)定離子色譜圖

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg·mL－1），加水制成1、5、20、50、100、200μg·mL－1的溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.237 8 X－0.036 1（r＝0.999 9），硫酸根在 0.025～5.000μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.2.3 供試品溶液的制備 取白術(shù)粉末（過(guò)四號(hào)篩）約5 g，精密稱定，置瓶 A（兩頸燒瓶）中，加水50 mL，振搖，使分散均勻，接通水蒸氣蒸餾瓶。吸收瓶B（100 mL量瓶）中加入3%過(guò)氧化氫溶液20 mL作為吸收液，吸收管下端插入吸收液液面以下。A瓶中沿瓶壁加入5 mL鹽酸，迅速密塞，開(kāi)始蒸餾，保持C瓶沸騰并調(diào)整蒸餾火力，使吸收管端的餾出液的流出速率約為2 mL·min－1。蒸餾至瓶B中溶液總體積約為95 mL，用水洗滌尾接管并將其轉(zhuǎn)移至吸收瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，放置1 h后，以0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3.2.4 方法學(xué)考察 取對(duì)照品溶液測(cè)定6次，進(jìn)行精密度考察；取供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、24 h測(cè)定，進(jìn)行穩(wěn)定性考察；另取白術(shù)粉末（過(guò)四號(hào)篩）約5 g，共6份，按3.2.3制備并測(cè)定，進(jìn)行重復(fù)性考察；再取白術(shù)粉末（過(guò)四號(hào)篩）約2.5 g，共6份，分別精密加入一定量的亞硫酸鈉對(duì)照品，按3.2.3測(cè)定，進(jìn)行加樣回收率考察。結(jié)果表明，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率測(cè)定結(jié)果的RSD值均在2.0%以內(nèi)；樣品溶液二氧化硫殘留量平均質(zhì)量濃度為 220 mg·mL－1，24 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定，平均加樣回收率為97.52%。

3.2.5 樣品測(cè)定 分別取白術(shù)粉末（過(guò)四號(hào)篩）15批，按3.2.3制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液25μL，按3.2.1色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算樣品中的硫酸根含量，按照（SO2／SO42－＝0.666 9）計(jì)算樣品中二氧化硫的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)硫熏前后白術(shù)中化學(xué)成分進(jìn)行定性篩選，并通過(guò)硅膠柱色譜分離制備和波譜數(shù)據(jù)分析確證硫熏對(duì)白術(shù)中產(chǎn)生影響的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步考察硫黃熏蒸程度對(duì)白術(shù)中東莨菪內(nèi)酯和傘形花內(nèi)酯的相關(guān)性。由于白術(shù)中傘形花內(nèi)酯含量非常低且液相色譜分離效果不佳，本次實(shí)驗(yàn)僅以東莨菪內(nèi)酯為指標(biāo)，采用離子色譜法和高效液相色譜法分別對(duì)白術(shù)中二氧化硫殘留量和東莨菪內(nèi)酯的含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果重復(fù)性良好，方法可行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫熏對(duì)白術(shù)中香豆素類成分東莨菪內(nèi)酯和傘形花內(nèi)酯有顯著的影響，其中東莨菪內(nèi)酯含量隨著二氧化硫殘留量增加，整體呈下降趨勢(shì)直至為零。為了避免活性成分的下降，保證藥材及飲片的質(zhì)量，進(jìn)而確保臨床療效，建議研究白術(shù)合理適量硫磺熏蒸的加工方法，并制定合理的二氧化硫殘留量限度。