柘木多酚和氧化白藜蘆醇的制備與其抗氧化活性研究△

趙建萍，陳倩，曹俊東，唐崇明，李雅麗，劉江云*

（1.上海城建職業(yè)學院健康與社會關懷學院，上海 201415；2.蘇州大學醫(yī)學部藥學院中藥系，江蘇 蘇州 215123；3.常州技師學院，江蘇 常州 213000；4.云南省第一人民醫(yī)院藥學部，云南 昆明 650032；5.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院VIP內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011）

柘木為?？畦蠈僦参镨蠘銫udrania tricuspidata（Carr.）Bur或構棘 Cudrania cochinchinensis（Lour.）Kudo et Masam.去皮后的干燥根或藤莖。柘木是我國傳統(tǒng)中藥材，始載于宋代 《嘉佑本草》，其性味甘溫無毒，功能清熱涼血、舒筋活絡，主治婦人“崩中血結，瘧疾”、咯血、腰腿疼痛以及跌打損傷等癥。柘樹又名柘，柘桑，其根（穿破石）、樹皮或根皮（柘木白皮）、莖葉、果實亦供藥用[1-2]?，F(xiàn)有柘木糖漿、柘木顆粒等中成藥，臨床用于胃腸道腫瘤患者化療或放療的輔助治療?，F(xiàn)代化學成分研究資料表明，柘木中主要含有豐富的 酮、異戊烯基黃酮、黃酮醇、異黃酮等黃酮類成分[3-5]，此外還含有生物堿、香豆素、白藜蘆醇、三萜[6]、多糖[7]等多種成分[1]。柘木中的這些成分具有抗氧化[8]、抗腫瘤[9]、酪氨酸酶抑制[10-11]、消炎鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[1]。柘木在藥品、食品添加劑、美容美白產(chǎn)品等方面具有開發(fā)價值，近年來逐漸受到學者關注。本實驗對柘木總多酚的制備工藝及其抗氧化活性進行研究，為闡釋柘木藥效物質基礎和進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 柘木莖（批次20130510）藥材購自安徽安國藥材市場，經(jīng)蘇州大學藥學院陸葉博士鑒定為?？浦参镨蠘銫udrania tricuspidata（Carr.）Bur.的干燥藤莖。

1.1.2 試劑 氧化白藜蘆醇（純度97.2%）、蘆丁（純度94.5%）對照品由本實驗室自制，經(jīng)NMR、UV數(shù)據(jù)進行鑒定，其純度采用液相峰面積歸一法計算；DPPH（1，1’-二苯基-2-三硝基苯肼）和 ABTS（2，2’-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）購自日本東京化成工業(yè)株式會社。AB-8、LX2000大孔吸附樹脂（西安藍曉科技有限公司）；ODS填料（75 mm，日本Cosmosil公司）；乙腈（色譜純，美國 Fisher公司）；色譜用純凈水（杭州娃哈哈公司）；過硫酸鉀、乙醇、甲醇等試劑（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.3 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；ODS色譜柱（5C18-AR-Ⅱ，4.6 mm×250 mm，日本Cosmosil公司）；AvanceⅢplus 500 MHz核磁共振儀（德國Bruker Daltonics公司）；UV-SPD-M20A紫外分光光度計（日本島津公司）；ME215S型電子天平（德國Starorious公司）。

1.2 方法

1.2.1 柘木多酚的提取分離 稱取干燥柘木莖藥材1 kg，砸碎，用8 L 75%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取1.5 h，藥渣再用8 L 75%乙醇加熱回流1 h，兩次提取液合并，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至2 L（每1 mL相當于0.5 g生藥材），即得提取液CTE。CTE上AB-8大孔樹脂柱（10 cm×100 cm，柱體積BV 800 mL），依次用水（5 L）、50%乙醇（4 L）、70%乙醇（4 L）洗脫（2 BV·h－1），分別收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，分別得到相應柘木多酚樣品CTP-1（7.46 g）、CTP-2（5.32 g）。

1.2.2 氧化白藜蘆醇的分離 取CTP-1樣品0.24 g，加甲醇20 mL超聲溶解，加水稀釋至40 mL，上LX2000樹脂柱（2.5 cm×50 cm，柱體積BV 100 mL），依次用30%、50%、70%、95%甲醇各200 mL洗脫（2 BV·h－1）。經(jīng)HPLC檢識，取30%甲醇水洗脫流分，濃縮，上C18反相柱（2.5 cm×50 cm，柱體積BV 100 mL），依次用25%、28%、31%、34%、37%甲醇各200 mL洗脫（2 BV·h－1）。34%甲醇洗脫流分經(jīng)HPLC檢識為單體，經(jīng)濃縮干燥，得到化合物1（51 mg；氧化白藜蘆醇）。采用 UV、1H-NMR和13C-NMR等波譜技術，參考相關文獻，對化合物1進行結構鑒定。

1.2.3 液相分析 參考相關文獻[12-14]并適當優(yōu)化，采用HPLC方法檢測柘木多酚和其中的氧化白藜蘆醇成分含量。液相分析條件：流動相為乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%A；15～18 min，10%～15%A；18～40 min，15%A；0～65 min，15% ～35%A）；檢測波長290 nm；柱溫30oC；流速1.0 mL·min－1；進樣量20μL。采用峰面積（Y）和樣品濃度（X，mg·mL－1）進行含量計算，氧化白藜蘆醇的線性方程為Y＝1.732×108X＋1.372×106（r＝0.999 8），在0.020 18～0.403 6 mg·mL－1范圍內(nèi)線性關系良好。

1.2.4 抗氧化活性測試 DPPH法參考課題組前期文獻方法[15]進行。取配好的0.04%DPPH乙醇溶液3 mL中加入800μL各濃度的樣品溶液，室溫避光反應30 min后用分光光度計測定517 nm處吸光度Ai。蘆丁作對照。按公式（1）計算各樣品對DPPH自由基的清除率。ABTS法參考文獻方法[15]進行。將生成的ABTS溶液用乙醇稀釋，使其在30℃、734 nm波長下的吸光度為0.70±0.05，即得到ABTS工作液。在試管中加入100μL的樣品溶液，再加入3.0 mL的ABTS工作液混勻，放置于暗處反應6 min，在734 nm處測吸光值為Ai。ABTS自由基清除率的計算公式同公式（1）。

上式中Ai為加入樣品反應后溶液的吸光值，Ab為未加樣品的DPPH工作液的吸光度值。根據(jù)清除率數(shù)據(jù)曲線計算半數(shù)清除率（IC50）。

2 結果

2.1 柘木多酚的制備

采用乙醇提取和AB-8大孔吸附樹脂純化方法，制備獲得柘木多酚 CTP-1和 CTP-2。CTP-1再經(jīng)LX2000樹脂和ODS色譜柱進一步分離，純化獲得化合物1。

化合物1：黃色粉末狀固體，易溶于甲醇、乙醇等。UV（MeOH）λmax：230，290 nm。1H-NMR（500 MHz，C3D6O）：δ8.55（1 H，br s，OH-2），8.37（1 H，br s，OH-4），8.15（2 H，br s，OH-3′，5′），7.40（1 H，d，J＝8.5 Hz，H-6），7.33（1 H，d，J＝16.4 Hz，H-a），6.88（1 H，d，J＝16.4 Hz，H-b），6.52（each 1 H，d，J＝2.1 Hz，H-2′，H-6′），6.43（1 H，d，J＝2.1 Hz，H-3），6.38（1 H，dd，J＝8.5，2.1 Hz，H-5），6.23（1 H，dd，J＝2.1，2.1 Hz，H-4′）。13C-NMR（125 MHz，C3D6O）：δ158.6（C-4），158.6（C-3′），158.2（C-5′），156.0（C-2），140.7（C-1′）， 127.3（C-b），125.3（C-a），123.4（C-1），116.4（C-6），107.5（C-2′），104.6（C-3），104.5（C-4′），102.7（C-5），101.2（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的氧化白藜蘆醇NMR數(shù)據(jù)[16-17]對照一致，鑒定為氧化白藜蘆醇。見圖1。

圖1 氧化白藜蘆醇結構

采用液相分析，測定柘木多酚CTP-1、CTP-2中主要成分氧化白藜蘆醇的含量分別為21.25%、19.87%。其液相色譜見圖2。

圖2 柘木多酚CTP-1、柘木多酚CTP-2的HPLC圖

2.2 抗氧化測試

采用DPPH、ABTS兩種自由基清除率分析方法，以蘆丁作為對照品，對柘木多酚CTP-1、CTP-2以及氧化白藜蘆醇的抗氧化活性進行測定。各樣品對DPPH自由基的清除率見表1，可見測試樣品對該自由基具有很強清除率，并呈量效依賴關系。根據(jù)清除率隨樣品溶液濃度變化的數(shù)據(jù)，計算出CTP-1、CTP-2、氧化白藜蘆醇及蘆丁對該自由基的IC50分別為 19.12±0.37、25.31±0.05、11.20±0.13、9.74±1.98μg·mL-1。

各樣品對ABTS自由基的清除率見表2?？梢姕y試樣品對該自由基具有較強清除率，并呈量效依賴關系；其抗氧化活性均強于對照品蘆丁。根據(jù)清除率隨樣品溶液濃度變化的數(shù)據(jù)，計算出 CTP-1、CTP-2、氧化白藜蘆醇及蘆丁對照品對該自由基的IC50分別為 49.32±0.68、60.13±2.02、29.70±0.73、181.6±0.64μg·mL-1。

表1 不同濃度柘木多酚樣品對DPPH自由基清除率

表2 不同濃度柘木多酚樣品對ABTS自由基清除率

3 結論

柘木中主要成分為多酚類化合物。本文采用大孔吸附樹脂法，對柘木多酚的制備工藝進行了研究，并對其中主要成分進行分離和鑒定。分離鑒定和HPLC檢測結果表明，柘木多酚中的主要成分為氧化白藜蘆醇。文獻報道柘木中存在白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇類成分，但其主要含有槲皮素、二氫桑色素、山柰素等黃酮及其苷類成分[2，13-14]。本文首次發(fā)現(xiàn)，柘木中含有高含量的氧化白藜蘆醇，與已有文獻有較大差別，推測這可能是由于白藜蘆醇類成分是強氧化劑，容易在長時間加熱提取、濃縮、分離過程中氧化變性有關[18]。采用大孔樹脂分段制備，結合小孔樹脂、反相硅膠進行分離，具有分離效率高、實驗操作條件溫和的優(yōu)點，并可有效避免樣品長期高溫濃縮過程中失活、硅膠色譜柱吸附嚴重等缺陷。液相色譜圖中可見，柘木多酚中還含有復雜的多種多酚類組分色譜峰，推測為文獻報道的其它黃酮類成分[1，3-5]。

進一步的抗氧化活性測試結果表明，兩種柘木多酚對DPPH、ABTS兩種自由基均具有強抑制作用，這顯然與其中含有的高含量氧化白藜蘆醇有關，同時柘木中的其它多種復雜組分（圖1）也對其抗氧化作用有所貢獻。白藜蘆醇類成分是公認有益的優(yōu)良抗氧化劑[8，18-20]，柘木中富含氧化白藜蘆醇，可作為優(yōu)良的抗氧化劑進行開發(fā)，應用于食品添加劑、美白化妝品等領域。