柑橘采后病害生防木霉的篩選與鑒定

羅紅霞，欒豐剛，張 揚(yáng)，李 冬*

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柑橘采后病害生防木霉的篩選與鑒定

羅紅霞1，欒豐剛2，張 揚(yáng)2，李 冬2*

（1. 江西省九江市林業(yè)有害生物防治檢疫局，江西 九江 332000；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045）

從毛竹林土壤中分離得到9株木霉菌株，采用平板對峙法評估了9株木霉菌對4種柑橘產(chǎn)后病害病原菌的抑制效果，并利用ITS及2基因序列分析鑒定木霉菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）9株木霉對柑橘青霉病菌具有較好的抑制效果，對峙培養(yǎng)7 d的抑制率均達(dá)到100%；9株木霉對其它3種柑橘產(chǎn)后病害的抑制率不同，其中菌株T2對柑橘黑腐病抑菌效果最好，抑制率達(dá)85.84%；菌株T3和T8對柑橘酸腐病菌抑制效果最好，抑制率達(dá)100%；菌株T3、T5和T6對柑橘綠霉病菌抑制效果最好，抑制率達(dá)80%。（2）共鑒定木霉菌3種，其中哈茨木霉（）6株（T1、T3、T5、T7、T8和T9），為優(yōu)勢種；綠木霉（）2株（T2和T4）；綠色木霉（）1株（T6）。

生物防治；木霉菌；拮抗；柑橘采后病害

木霉屬是土壤微生物的重要類群，廣泛分布于世界各地。由于木霉可以產(chǎn)生纖維素酶及其它水解酶和多種次生代謝產(chǎn)物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，木霉具有顯著的植物病原菌拮抗活性和生物防治潛力，國內(nèi)外學(xué)者對其拮抗作用及機(jī)制作了較為系統(tǒng)深入的研究，并開發(fā)了多種商業(yè)化生防菌劑及生物菌肥用于農(nóng)作物保護(hù)[1-4]，該屬真菌已經(jīng)成為研究和應(yīng)用最多的植物病害生防菌。

自Persoon（1794）建立了木霉菌屬（Pers.）以來，關(guān)于該屬的分類經(jīng)歷了較大的變化，如e的有性型為[5]、9個(gè)集合種（species aggregate）分類體系[6]、5個(gè)組（section）分類系統(tǒng)[7]以及將Saturnisporum組并入到Longibrachiatum組的4個(gè)組分類體系[8]。隨著分子系統(tǒng)學(xué)應(yīng)用于木霉屬分類研究，為開展木霉屬的鑒定提供了有效的技術(shù)參考。如Druzhinina等[9]建立了木霉屬與肉座菌屬物種的DNA條形碼序列（ITS1和ITS2）鑒別系統(tǒng)OKey v. 1.0。Kopchinskiy等[10]建立了專門用于木霉屬與肉座菌屬物種序列檢索的BLAST數(shù)據(jù)庫。Zhu等[11]比較了基于、2和1基因的種內(nèi)與種間序列差異及序列獲取難易程度，認(rèn)為2最小種間差異大于最大種內(nèi)差異，且PCR擴(kuò)增與測序成功率較高（94.4%），可作為木霉屬的補(bǔ)充條形碼。

隨著木霉分子系統(tǒng)學(xué)研究加速，新的物種不斷被發(fā)現(xiàn)。截至2015年，木霉屬包括254個(gè)種及2個(gè)變種[11]。我國學(xué)者也在木霉屬資源與系統(tǒng)分類研究方面做了大量工作，迄今我國已報(bào)道的木霉屬真菌有118種[12-19]，體現(xiàn)出了較高的物種多樣性。然而，我國目前對木霉菌屬的研究多集中在華東、西南和東北地區(qū)，而其他地區(qū)的研究相對較少。

柑橘是世界第一大果[20]，也是我國南方栽培的主要水果之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[21]。目前，我國柑橘仍以鮮果銷售為主，為滿足長期供應(yīng)，柑橘需要在采收后經(jīng)過較長時(shí)間的貯藏與運(yùn)輸。由于柑橘果實(shí)含水率高、營養(yǎng)豐富，在采收、貯藏及運(yùn)輸過程中極易受到各種病原真菌感染[22]。目前，常見且發(fā)生嚴(yán)重的柑橘產(chǎn)后病害主要有綠霉?。ǎ?、青霉?。ǎ?、酸腐病（）[22]及黑腐?。ǎ?，其中綠霉病與青霉病引起的損失占所有采后病害90%以上[23]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年柑橘因采后病害而造成的損失一般為10%左右，個(gè)別年份高達(dá)30%以上[24]。因此，如何預(yù)防及降低柑橘采后病害的發(fā)生已成為國內(nèi)外開發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。

迄今為止，國內(nèi)外控制柑橘采后病害主要措施仍是化學(xué)殺菌劑處理，常見藥劑有多菌靈、甲基托布津、苯萊特等。由于化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，除了農(nóng)藥殘留給人們健康帶來隱患外，還導(dǎo)致病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，降低了化學(xué)殺菌劑的防治效果。因此，本研究擬重點(diǎn)解決以下問題：（1）分離篩選柑橘主要產(chǎn)后病害病原菌拮抗木霉；（2）明確拮抗木霉的分類地位。通過試驗(yàn)研究，以期為木霉菌在柑橘采后病害生物防治中的應(yīng)用提供菌種資源及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和材料

供試菌株：4種柑橘采后病害病原菌由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系向妙蓮老師惠贈；木霉菌（T1-T9）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

表1 供試木霉菌株信息

1.2 拮抗木霉菌的篩選

參考Dennis & Webster（1971）[25]的平板對峙法并稍作修改。將已初篩具有拮抗活性的木霉菌株與病原菌平板培養(yǎng)后，使用打孔器將病原菌和木霉切成直徑6 mm的菌絲塊，木霉接種至PDA平板中央，病原菌接種至距離平板邊緣約2 cm處，每皿放4塊病原菌，置放入25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以僅接種病原菌純培養(yǎng)為對照。168 h后觀察并測量病原菌的菌落半徑，按以下公式計(jì)算木霉菌的抑制率：

其中：d為對照組接種植物病原菌后168 h的直線生長距離；d為對峙培養(yǎng)組接種植物病原菌后168 h的直線生長距離。

1.3 拮抗木霉菌的鑒定

采用CTAB法提取木霉菌株總DNA，采用引物ITS4和ITS5對ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增[26]，用引物983F和2218R對RPB2序列進(jìn)行擴(kuò)增[27]。雙向測序后采用DNAstar中的Seqman 7.1.0軟件包[28]進(jìn)行序列拼接，并采用人工校正個(gè)別位點(diǎn)的錯誤信息。將測得ITS及RPB2序列提交至GenBank獲得登錄號，并分別在ISTH（International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy）的OKEY v. 2.0[8]和BLAST v. 1.0[9]進(jìn)行Blast比對鑒定其分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌對幾種植物病原菌的拮抗效果

由表2可看出：9株木霉菌對柑橘青霉病菌抑制效果較好，抑制率均為100%；對柑橘黑腐病拮抗效果最好的是菌株T2，菌株T6次之；對柑橘酸腐病菌拮抗效果最好的是菌株T3和T8，抑制率為100%；對柑橘綠霉病菌抑制效果較好的木霉菌株是T3、T5和T6，抑制率為80%。

圖1 不同木霉菌株對柑桔酸腐病菌的拮抗作用

從木霉菌株來看，除菌株T9對柑橘黑腐病抑制率（35.39%）較低外，其余8株木霉對4種柑橘產(chǎn)后病害病原菌的抑制率均超過了60%，即8株木霉對4種柑橘產(chǎn)后病害病原菌有一定的抑菌活性。

表2 木霉菌株對不同植物病原菌的抑制率

2.2 拮抗木霉的分子鑒定

基于ITS基因序列在OKEY v. 2.0比對結(jié)果可知：本研究的9株木霉菌以哈茨木霉（）為主，其中6株木霉（T1、T3、T5、T7、T8和T9）在系統(tǒng)發(fā)育上與哈慈木霉親緣關(guān)系最近；菌株T6與綠木霉（）親緣關(guān)系最近，而菌株T2和T4與擬康寧木霉（）親緣關(guān)系最近。

表3 基于ITS序列的TrichOKEY v2.0比對結(jié)果

表4 基于rpb2基因的TrichBLAST v.1.0比對結(jié)果

基于2基因序列輸入BLAST v. 1.0比對結(jié)果可知：7株木霉（T1、T3、T5、T6、T7、T8和T9）與OKEY v. 2.0比對結(jié)果基本一致，而2株木霉（T2和T4）基于2基因序列blast結(jié)果為綠色木霉（）。依據(jù)Zhu等[11]對于木霉菌ITS、2和1基因鑒定準(zhǔn)確性的評價(jià)，2基因比ITS基因更適合作為木霉屬的補(bǔ)充條形碼，本研究據(jù)此認(rèn)為菌株T2和T4鑒定為綠色木霉（）更為合適。

3 討 論

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展以及人們對果蔬產(chǎn)品需求量的增加，柑橘作為世界主要水果之一，其種植面積及產(chǎn)量也不斷擴(kuò)大，而其產(chǎn)后病害也日益突出，成為影響柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因子之一。目前，化學(xué)防治仍然是柑橘產(chǎn)后病害的主要措施之一。然而，殺菌劑的廣泛使用帶了諸多問題，如農(nóng)藥殘留、病原菌抗性增加、生態(tài)平衡破壞等，進(jìn)而造成殺菌劑效果下降、用量增加，甚至防治無效等后果[29-30]。如在柑橘上長期適應(yīng)苯并咪唑類殺菌劑，使得原來對其不敏感的柑橘黑腐病與柑橘酸腐病菌種上升成為主要病害病原菌[31]。因此，尋找安全、經(jīng)濟(jì)、高效的生物防治成為研究的熱點(diǎn)。

迄今為止，利用拮抗真菌對植物病害進(jìn)行生物防治的研究相當(dāng)多，但多數(shù)研究多限于實(shí)驗(yàn)室條件下，生產(chǎn)應(yīng)用較為成功僅為少數(shù)，如木霉（）、盾殼霉（）、毛殼霉（）等，其中以木霉作為生物載體的生防菌劑或菌肥開發(fā)應(yīng)用最多，全球已注冊的產(chǎn)品超過50種[32]，如以色列MakhteshimAgan公司以哈茨木霉為生物載體開發(fā)的產(chǎn)品Trichodex用于防治由灰葡萄孢引起的蔬菜和葡萄病害；新西蘭Agrimm Bilogicals公司以木霉（包括哈茨木霉和綠色木霉）為生物載體開發(fā)的產(chǎn)品Trichodwels用于防治各種土傳病害及由紫韌革菌引起的銀葉?。幻绹镛r(nóng)藥公司BioWorks以木霉（包括哈茨木霉和綠色木霉）為生物載體開發(fā)的RootShield用于防治輸出及其它作物猝倒病。由此可見，木霉在植物病害生物防治方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。

本研究的9株木霉對4種主要的柑橘產(chǎn)后病害均有一定的抑菌活性，除菌株T9對柑橘黑腐病菌抑菌效果較差外，其余8株木霉對4種柑橘產(chǎn)后病害均表現(xiàn)出一定的抑菌活性。9株木霉除了對柑橘青霉病菌抑制效果一致較好以外，而對其它3種柑橘產(chǎn)后病害表現(xiàn)出不同的抑制效果。從生長速度上看，木霉菌具有高于柑橘產(chǎn)后病害病原菌的生長速度，因此，木霉菌可覆蓋病原菌并通過競爭作用達(dá)到抑菌目的。由于柑橘產(chǎn)后病害防治對象為柑橘果實(shí)，直接以拮抗木霉開發(fā)菌劑（如粉劑、水劑等）進(jìn)行生物防治可能存在諸多問題。課題組進(jìn)行了木霉發(fā)酵液粗提物平板抑菌（圖2）初步試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木霉粗提物中含有抑菌物質(zhì)，今后將重點(diǎn)獲得純化的抑菌活性成分，將對開發(fā)利用木霉防治柑橘產(chǎn)后病害更為有利。

圖2 木霉菌株T9發(fā)酵液對柑桔酸腐病菌的抑制作用

本研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析將供試9株木霉鑒定為3種：其中包括6株哈茨木霉（），2株為綠色木霉（）及1株綠木霉（），表現(xiàn)出較高的物種多樣性。結(jié)合9株木霉對3種柑橘產(chǎn)后病害（柑橘青霉病除外）病原菌的抑菌效果來看：綠色木霉菌株T2對柑橘黑腐病抑制效果最好；哈茨木霉菌株T3和T8對柑橘酸腐病抑菌率最高；而哈茨木霉菌株T3與T5及綠木霉菌株T6則對柑橘綠霉病表現(xiàn)出較好的抑菌活性。然而，本試驗(yàn)尚未就供試菌株的抑菌機(jī)理及實(shí)際防病效果進(jìn)行研究，后續(xù)試驗(yàn)將對上述問題做進(jìn)一步研究。

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Screening and Identification ofStrains in Biological Control of Post-harvest Diseases of Citrus

LUO Hong-xia1, LUAN Feng-gang2, ZHANG Yang2, LI Dong2*

(1. Forest Pest Control and Quarantine Bureau of Jiujiang, Jiujiang, Jiangxi 332000, China; 2. College of Forestry, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Nine strains ofspp. from soils in different bamboo forests in Jiangxi Province were evaluated, and their antagonism against,,, andwere got by flat dilution. And then strains ofspp. were identified with the sequences of ITS and2. The results showed that: (1) nine strains ofhad antagonism against, and the inhibition effects (IE) reached 100% in 7 days. There were different inhibition effect on other three pathogens of,, and. Thestrain T2 had the significant antifungal effects on, with the IE up to 85.84%. Thestrains T3 and T8 had powerful antagonism against, with the IE up to 100%. And the inhibitory effects ofstrains T3, T5 and T6 were the best, with the IE up to 80%. (2) Three species among the nine strains ofspp. were identified, of whichwas a dominant species, which included six strains (T1、T3、T5、T7、T8 and T9). Two strains ofspp. (T2 and T4) belonged to, while only onestrain (T6) belonged to.

biological control;; antagonist; post-harvest diseases of citrus

S436.66.1+9

A

2095-3704（2018）03-0192-06

2018-07-18

國家自然科學(xué)基金(31560203)、江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20171BAB204026)和江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ160363)

羅紅霞（1971—），女，工程師，主要從事林業(yè)微生物研究，LFG7869@126.com；

李冬，副教授，jxld2008@163.com。

羅紅霞, 欒豐剛, 張揚(yáng), 等. 柑橘采后病害生防木霉的篩選與鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(3): 192-197.