頭皮叢刺對焦慮模型大鼠HPA軸CRH、ACTH作用及分子機制研究*

楊建飛，王 紅，鄭祖艷△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

焦慮障礙又稱焦慮癥,指患者長期處于緊張焦慮不安狀態(tài)，導(dǎo)致自主神經(jīng)持續(xù)興奮，長期的過度焦慮為表現(xiàn)的一種慢性焦慮性疾病,是最常見的一種焦慮障礙[1]。經(jīng)過大量臨床驗證，針灸治療焦慮癥療效確切，且不良反應(yīng)輕微短暫[2]，有臨床研究報道，運用針灸治療可以改善患者焦慮癥狀，針灸和藥物聯(lián)合治療患者焦慮癥療效明顯優(yōu)于單純藥物治療，并且結(jié)合針灸治療能夠減輕藥物帶來的不良反應(yīng)，針灸治療焦慮癥其療效確切，值得在臨床中進行推廣[3]。但關(guān)于針灸治療焦慮癥機理研究較少，治療機理不明確，深入研究治療機理有助于進一步針藥結(jié)合加強療效，故研究針灸治療焦慮癥的機理對臨床有重要的指導(dǎo)意義。

本實驗動物模型制備模擬人受到應(yīng)激刺激的過程,制造應(yīng)激焦慮模型大鼠,并以此為研究對象，探討頭皮叢刺對焦慮癥的治療療效及作用機理，從而為臨床治療提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級8周雄性SD大鼠，共48只,體質(zhì)量180～200 g,實驗動物由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心購買。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。通過應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行大鼠的隨機分組，分為空白組(16只)、模型組(16只)和頭皮叢刺組(16只)。實驗遵照《實驗動物倫理與福利》和《關(guān)于善待實驗動物指導(dǎo)性意見》相關(guān)要求。

1.2 試劑與儀器

電子秤(天津醫(yī)療器械廠)，-70℃冰箱(日本日立公司)，自制敞篷(長80 cm，寬80 cm，高40 cm)，華佗牌針灸針，恒溫高速離心機(日本日立公司)，電針治療儀(青島鑫升實業(yè)有限公司)，BA200數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團公司),Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國MediaCy-bernetics公司),十字迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 造模方法

造模方法參照Bondi CO等的方法[4]，通過慢性不可預(yù)知的應(yīng)激性刺激，對大鼠進行焦慮癥模型的復(fù)制。造模過程具體為：模型組與頭皮叢刺組分別飼養(yǎng)于鼠籠，兩組大鼠在接下來的14天內(nèi)，受到不同的應(yīng)激性刺激,每天隨機選取一種應(yīng)激刺激方法。各種方法包括放入高溫環(huán)境(45℃,5 min)、冷水刺激(4℃,5 min)、大鼠容器的搖晃(1次/s,15 min) 、夾尾3 min、足底電擊(電壓50 mV,每隔1 min刺激1次,每次持續(xù)10 s，共30次) 、禁食48 h、禁水24 h等應(yīng)激性刺激方法,刺激前予持續(xù)10 s的鈴聲提示。正常對照組每次抓取前也給予10 s鈴聲提示，但鈴聲提示后不施予上述方法。

1.4 針刺方法

經(jīng)過14天應(yīng)激性刺激造模后，頭皮叢刺組行電針治療，參照《實驗動物穴位圖譜》定位，在大鼠頭部選取“百會”“神庭”“四神聰”穴，毫針針刺治療，針刺時向后平刺0.2 cm左右，“百會”“神庭”穴針柄接電針治療儀，其頻率設(shè)置為2 Hz，其電流設(shè)置為0.6 mA。連續(xù)針刺14天后進行后續(xù)測試及檢測，每日針刺大鼠1次，每次針刺留針20 min。

1.5 行為學(xué)測試方法

大鼠在實驗第14天，通過高架十字迷宮實驗測試大鼠焦慮水平。高架十字迷宮由4個臂區(qū)組成，4個臂區(qū)為十字對稱分布，相對為同一臂區(qū)，分別為開臂區(qū)和閉臂區(qū)。通過迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)的紀錄，計算出5 min內(nèi)大鼠在開臂區(qū)活動(OT)和進入開臂區(qū)的次數(shù)(OE)，通過軟件計算出大鼠進入開臂區(qū)停留總時間進入總次數(shù)的百分比(OT%和OE%)。大鼠在開臂區(qū)的時間越少(即OT%越小)或進入次數(shù)越少(即OE%越小)表示大鼠越焦慮。

1.6 取材及檢測方法

實驗結(jié)束后，乙醚麻醉大鼠，股動脈采血。每組隨機取鼠8只，麻醉斷頭取腦，分離鼠下丘腦，通過石蠟包埋、切片及免疫組化等方法檢測各組大鼠下丘腦內(nèi)CRH、ACTH、CORT、NPY含量。采用酶聯(lián)免疫法檢測血漿CRH、ACTH、CORT含量。每組取另8只大鼠，麻醉分離下丘腦，低溫高速離心后取上層清液，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測下丘腦中NPY受體YlmRNA、Y5mRNA水平的表達。

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

實驗造模中,各組大鼠無死亡，行為學(xué)測試當天，剔除1只模型組大鼠(原因：嚴重殘疾)；在取血和取下丘腦的操作中，模型組和頭皮叢刺組大鼠均有不同程度的樣本損失。

2.1 各組高架十字迷宮行為學(xué)測試結(jié)果比較

與空白組相對比，模型組大鼠的OE%值顯著下降(P<0.05)；與模型組相對比，頭皮叢刺組大鼠的OE%值顯著升高(P<0.05)。各組OT%值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高架十字迷宮行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠表現(xiàn)出焦慮的狀態(tài)，本實驗焦慮大鼠造模方法成功；且頭皮叢刺可以顯著減少動物焦慮行為。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)測試結(jié)果比較

注：與空白組比較，**P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2 各組血漿CRH、ACTH、CORT含量比較

與空白組對比，模型組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT濃度明顯變化(P<0.05)；與模型組對比，頭皮叢刺可明顯改善模型大鼠血漿CRH、ACTH、CORT的濃度(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血漿CRH、ACTH、CORT含量比較(pg/mL)

注：與空白組比較，**P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.3 各組下丘腦CRH、ACTH、CORT、NPY含量比較

與空白組對比，模型組大鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT、NPY濃度明顯變化(P<0.05)；與模型組對比，頭皮叢刺能明顯改善模型大鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT、NPY的濃度(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT、NPY含量比較(ng/L)

注：與空白組比較，**P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.4 各組NPY受體Y1mRNA、Y5mRNA含量比較

與空白組相對比，模型組下丘腦中NPY受體Y1mRNA、Y5mRNA濃度顯著提高(P<0.05)；與模型組相對比，頭皮叢刺能夠顯著降低大鼠下丘腦中NPY受體Y1mRNA、Y5mRNA水平(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦NPY受體Y1mRNA、Y5mRNA含量比較

注：與空白組比較，**P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3 討論

焦慮障礙是常見的精神障礙疾病。隨著現(xiàn)代社會的不斷發(fā)展,本病發(fā)病率顯現(xiàn)出逐年升高趨勢,成為嚴重影響人類生活質(zhì)量的疾病之一[5]?，F(xiàn)階段治療焦慮障礙以患者服用抗焦慮作用藥物為主，雖然藥物治療療效較好，但存在藥物依賴、副反應(yīng)大等缺點。針刺治療焦慮癥有獨特優(yōu)勢，且得到臨床上的驗證，取得了一定的成果[6]。

中醫(yī)學(xué)無“焦慮障礙”的病名，分析其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于 “情志病”等疾病[7]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提出“思則氣結(jié)”“驚則氣亂”，情志所傷后導(dǎo)致氣機失調(diào)是焦慮癥發(fā)病的首要因素。所以，治療本病關(guān)鍵應(yīng)為調(diào)神健腦、調(diào)暢氣機[8]。

本實驗中采用頭皮叢刺法治療，以達到健腦調(diào)神、通暢氣機的目的。頭為諸陽之會、腦為元神之府。通過從古至今大量臨床經(jīng)驗總結(jié),頭皮叢刺法積累了非常完善的經(jīng)驗，古籍記載均為現(xiàn)代醫(yī)家提供了治療參考指導(dǎo)[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，HPA軸功能亢進,可以引起機體一系列病理生理反應(yīng), 其中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)等在病理生理反應(yīng)過程中起重要作用， NPY系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)HPA軸[10]。造模成功后大鼠血漿NPY、CORT和ACTH和CRH水平均顯著變化，表明NPY系統(tǒng)和HPA軸同時被激活，而且說明NPY系統(tǒng)與HPA軸有一定的相關(guān)性。

本實驗研究結(jié)果表明,頭皮叢刺對焦慮癥有一定的治療效果，并且這種作用是通過作用于HPA軸實現(xiàn)的，本研究為進一步探討頭皮叢刺抗焦慮的作用機制研究奠定了基礎(chǔ)，為臨床更廣泛地開展頭皮叢刺治療焦慮癥提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。但本研究結(jié)論仍需進一步的臨床及實驗研究加以驗證。