膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠相關(guān)穴位敏化的肥大細(xì)胞機(jī)制研究*

王巧俠，丁 寧，姜 婧，劉瀟瀟，秦萍萍，許藝元，胡嘉同，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

穴位是人體臟腑經(jīng)絡(luò)之氣輸注于體表的特殊部位，是針灸治療疾病的特殊部位，也是針灸的主要研究對象。穴位由生理狀態(tài)下的“靜息態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)椴±頎顟B(tài)下的“激活態(tài)”，并實(shí)現(xiàn)接受刺激、調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)的功能即為穴位敏化[1-2]。

肥大細(xì)胞(Mast Cells,MC)是重要的免疫細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)MC在穴位敏化中扮演了重要的角色[3-5]。在解剖層面上，穴位處于一定厚度的結(jié)締組織中[6-8]。實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)MC與經(jīng)絡(luò)相關(guān)[9]，而在對穴位敏化的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)MC與穴位的生物物理特性關(guān)系密切[10-12]，研究已經(jīng)證實(shí)了穴位組織切片中有MC[13]，且穴區(qū)MC的數(shù)量高于非穴區(qū)[14-15]。MC與穴位有密切的關(guān)系，MC是穴位重要的組織形態(tài)學(xué)依據(jù)，也是穴位功能的重要載體，穴區(qū)MC的募集和脫顆粒在組織學(xué)上被認(rèn)為針灸治療的反應(yīng)。MC通過針刺釋放的炎性介質(zhì)誘導(dǎo)神經(jīng)免疫應(yīng)答來完成效應(yīng)，此外，這些炎性介質(zhì)在循環(huán)、神經(jīng)和免疫網(wǎng)絡(luò)之間有著至關(guān)重要的作用[16-18]。目前關(guān)于穴位敏化的研究大多聚焦于MC上，但對MC的研究僅限于針刺干預(yù)期，重點(diǎn)關(guān)注于MC對針刺穴位或者效應(yīng)器官的反應(yīng)，從而忽視了不同程度疾病的MC的變化及在穴位敏化過程中MC具體的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過研究不同程度膝骨關(guān)節(jié)炎模型鶴頂穴、陽陵泉及委中穴穴區(qū)MC在穴位敏化第7天的形態(tài)和功能的變化試說明在疾病的早期，不同程度疾病不同穴位穴區(qū)肥大細(xì)胞的變化情況及穴位是否致敏以及穴位敏化過程中穴位處的循環(huán)、神經(jīng)、免疫網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，幫助理解針刺效應(yīng)的科學(xué)原理，對疾病早期的臨床診斷和治療有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級SD雄性大鼠40只購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002]，體質(zhì)量150～160 g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室，空氣流通，相對濕度60%，12 h晝夜循環(huán)光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為正常對照組(N)、生理鹽水組(NS)、輕度關(guān)節(jié)炎組(A)、中度關(guān)節(jié)炎組(B)和重度關(guān)節(jié)炎組(C)5組，每組各8只。

1.2 主要試劑及儀器

單碘乙酸鹽(MIA)和水合氯醛(購于歐北生物科技有限公司);全自動(dòng)組織脫水機(jī)(ASP300S，德國徠卡儀器有限公司);半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245，德國徠卡儀器有限公司);自動(dòng)化智能型正置研究級顯微鏡(BX53奧林巴斯有限公司)、冰凍切片機(jī)(Leica Corpora-tion，Germany);激光共聚焦掃描顯微鏡(FV1000，Olympus Corporation，Japan)。

1.3 模型制備

采用Guingamp C等[19]的經(jīng)典MIA造模方法來制備膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，將MIA溶液注入大鼠右側(cè)膝骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并配合持續(xù)的抽屜樣關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)。具體操作步驟為：將MIA溶入到50 μL 9%的生理鹽水中，大鼠用水合氯醛麻醉(10%，0.04 mL/g，腹腔注射)后，清理關(guān)節(jié)附近的鼠毛，將關(guān)節(jié)屈曲到最大限度后于右膝關(guān)節(jié)腔注入配置好的藥液，A、B、C組大鼠分別注射0.3、1、3 mgMIA，NS組用同樣的方法于右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入50 μL 9%的生理鹽水，N組則不做處理。

1.4 取材

于造模后的第7天，將各組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，每組選取6只大鼠采用甲苯胺藍(lán)染色法來觀察穴區(qū)局部MC的募集和脫顆粒，另外2只采用免疫熒光染色技術(shù)來觀察穴區(qū)局部相關(guān)分子的表達(dá)。

1.4.1 甲苯胺藍(lán)染色 將動(dòng)物處死后，分別以鶴頂穴、陽陵泉穴和委中穴為中心取1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm體積大小的標(biāo)本(包含皮膚及皮下結(jié)締組織)，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定48 h后，使用組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水，采用石蠟包埋方法，進(jìn)行組織切片的制作，切片厚度為4 μm，切片方向?yàn)槠つw組織塊縱切面，隨后將各部分進(jìn)行脫蠟、脫氫和染色，采用0.5%甲苯胺藍(lán)染色30 min，自來水沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。

于自動(dòng)化智能型正置研究級顯微鏡上進(jìn)行圖像拍攝，拍攝倍數(shù)為10×40，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)算MC數(shù)量平均值，并記錄穴區(qū)MC脫顆粒情況，計(jì)算MC脫顆粒率及MC輕度和重度的脫顆粒率[20]。肥大細(xì)胞脫顆粒率=脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.2 免疫熒光染色 采用水合氯醛(10%，0.04 mL/g，腹腔注射)每組麻醉2只大鼠，并用4%多聚甲醛灌注。以鶴頂穴、陽陵泉和委中穴為中心取1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm體積大小的樣本(包含皮膚及皮下結(jié)締組織)，將樣本在4%多聚甲醛中固定2.5 h，并用25%蔗糖脫水2天。在-25℃下用冷凍切片機(jī)制備10 μm厚度的切片。一抗包括小鼠單克隆肥大細(xì)胞類胰蛋白酶抗體(1∶100，Abcam，USA)，山羊多克隆5-羥色胺(5-HT)抗體(1∶100，Abcam，USA)和兔多克隆組胺(HA)抗體(1∶200，LSBio，USA)。驢抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(1∶200，Abcam，USA)、驢抗山羊IgG Alexa Fluor 594(1∶200，Abcam，USA)和驢抗兔IgG Alexa Fluor 594(1∶200， Abcam，USA)用作相應(yīng)的二抗。使用溶液4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI，Solarbio，Beijing，China)進(jìn)行反染色。

雙重免疫組織化學(xué)染色步驟如下：將切片在0.1 MPB(pH = 7.4)中洗滌并在含有3%正常驢血清和0.5%Triton X-100的0.1M PB(pH=7.4)中封閉30 min。滴加用小鼠單克隆肥大細(xì)胞類胰蛋白酶抗體和山羊多克隆5-HT抗體于切片上，4℃孵育過夜。 PB洗滌后，在切片避光滴加Donkey抗小鼠IgG Alexa Fluor 488和Donkey Anti-Goat IgG Alexa Fluor 594 2 h。隨后，用PB洗滌切片并用DAPI避光染色6 min。用PB洗滌后，封片劑封片，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察切片。在60倍放大率下記錄雙重染色的MC數(shù)量和它們的脫顆粒程度。使用相同的染色方案進(jìn)行雙重免疫組織化學(xué)染色，以檢查肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和HA的共表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組不同穴位穴區(qū)MC數(shù)量的比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，同一穴位在不同組別比較，鶴頂穴的A、B、C 3組MC數(shù)量均高于N組和NS組(P<0.01)，A、B、C 3組MC數(shù)量隨疾病程度呈遞增趨勢。見表1。

表1 各組不同穴位穴區(qū)MC數(shù)量比較個(gè))

注：與N組比較，aP<0.01；與NS組比較，bP<0.01

2.2 各組MC脫顆粒率比較

不同組別同一穴位比較，A、B、C 3組鶴頂穴MC脫顆粒率隨疾病程度加重呈遞增趨勢，且C組穴區(qū)MC脫顆粒率高于N組(P<0.01)、NS組(P<0.01)及A組(P<0.01)。見表2。

表2 各組MC脫顆粒率比較

注：與N組比較，aP<0.01； 與NS組比較，bP<0.01；與A組比較，cP<0.01

2.3 不同程度疾病模型鶴頂、陽陵泉、委中三穴局部MC甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果

MC成圓形或橢圓形，其核呈圓形，細(xì)胞質(zhì)被嗜堿性紫色顆粒均勻點(diǎn)樣。鶴頂穴的一些MC顯示大量藍(lán)紫色顆粒分布在細(xì)胞之間，排列成束狀或帶狀。見封三彩圖1。

2.4 穴位敏化過程中鶴頂穴、陽陵泉和委中穴區(qū)局部肥大細(xì)胞類胰蛋白酶與5-HT、HA共表達(dá)情況

類胰蛋白酶與5-HT和HA共表達(dá)情況見于封三彩圖2和封三彩圖3，為了更好的說明類胰蛋白酶、5-HT、HA三者的表達(dá)情況，圖片選取了N組和C組作對比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)N組和NS組中，5-HT和HA的共表達(dá)水平較低。MC的脫顆粒較少，這與甲苯胺藍(lán)染色的結(jié)果一致。而在A、B和C組中，在鶴頂穴陽性染色細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度(表示類胰蛋白酶、5-HT和HA的表達(dá)水平較高)都有所增加。 在A、B和C組中，熒光顯示鶴頂穴的一些5-HT、HA和類胰蛋白酶釋放到細(xì)胞外區(qū)域，這與MC脫顆粒的特征相符。 此外，發(fā)現(xiàn)鶴頂穴免疫熒光染色的MC的數(shù)量，以及它們在A、B和C組的脫顆粒水平，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而趨于增加。而陽陵泉穴和委中穴中觀察到MC免疫熒光染色三者的共表達(dá)程度較低甚至無表達(dá)。

3 討論

穴位不僅是人體臟腑經(jīng)絡(luò)氣血輸注的特殊部位，同時(shí)也是疾病的反應(yīng)點(diǎn)和治療點(diǎn)[21]。甲苯胺藍(lán)染色分析結(jié)果顯示，A、B和C組鶴頂穴區(qū)MC的數(shù)量和脫顆粒率隨疾病程度增高而增加，模型組3組MC數(shù)量高于N和NS組，而MC顆粒率與N組和NS組存在差異的主要集中在C組，這些結(jié)果表明穴位敏化與MC的募集和脫顆粒水平有關(guān)。從鶴頂穴數(shù)據(jù)來看，穴位敏化與疾病程度成正相關(guān)，這與Ding N等[18]在14天的研究結(jié)果相符。而陽陵泉穴和委中穴，在MC的數(shù)量及脫顆粒率水平上沒有發(fā)生顯著變化，尚不能說明這兩個(gè)穴位在疾病過程中發(fā)生了穴位敏化等?？梢缘贸鲞@樣一個(gè)結(jié)論，穴位敏化期間MC的功能和形態(tài)變化是有穴位的特異性的，由3個(gè)穴位的對比可以發(fā)現(xiàn)，每個(gè)穴位發(fā)生敏化的條件是不相同的。而在相同條件下3個(gè)穴位之間的對比可以發(fā)現(xiàn)鶴頂穴區(qū)的MC數(shù)量及脫顆粒率要高于其他兩穴，說明鶴頂穴在造模后的第7天發(fā)生了敏化，且相較于陽陵泉穴和委中穴更容易敏化。由A、B、C 3組的對比可以看到，MC脫顆粒程度與疾病程度成正相關(guān)。

近年來對于穴位敏化過程中MC的募集和脫顆粒率變化機(jī)制主要集中在神經(jīng)纖維和血管的結(jié)構(gòu)上，課題組成員前期研究[18]結(jié)果提出MC的這種變化可能是循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)3個(gè)系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用的結(jié)果的假說。本試驗(yàn)在此研究基礎(chǔ)上，對膝骨關(guān)節(jié)炎第7天時(shí)穴位局部進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，穴位發(fā)生敏化的過程中，MC發(fā)生了募集和脫顆粒的變化，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示MC脫顆粒釋放的類胰蛋白酶的表達(dá)增加，并且在敏化過程中5-HT、和HA的表達(dá)也隨疾病程度的加重而增加，證實(shí)了5-HT和HA在穴位敏化過程中的正向表達(dá)。

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)隸屬中醫(yī)學(xué)“筋痹”“骨痹”“痹癥”等范疇[22]，其病因病機(jī)為肝腎虧虛及長期勞損，導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)，血瘀氣滯膝部，其病理表現(xiàn)主要為骨及軟骨的退行性變化，關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性缺失，軟骨下骨的壞死及由此引起的骨及軟骨的修復(fù)反應(yīng)[23]。實(shí)驗(yàn)中選用關(guān)節(jié)軟骨的病理切片來驗(yàn)證模型制備是否成功?；贕uzman等[24]研究發(fā)現(xiàn)用MIA造模后的第7天,軟骨下骨組織中的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)生變化，和Beyreuther等[25]發(fā)現(xiàn)在造模后的第5天大鼠膝關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥反應(yīng)，故實(shí)驗(yàn)中選取造模后第7天作為研究的時(shí)間點(diǎn)來觀察MC的變化過程。

針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎是經(jīng)過大量的臨床實(shí)踐總結(jié)，選穴方法成熟，療效顯著，可以緩解膝骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛并改善膝關(guān)節(jié)的功能，較其他物理療法效果顯著[26]，敏化態(tài)的穴位能作為疾病在體表的反應(yīng)部位對治療有較高的敏感性，選用易敏化的穴位作為治療穴位具有更高的臨床價(jià)值[27-28]。臨床上針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎主要選擇膝關(guān)節(jié)周圍的穴位、足陽明胃經(jīng)的穴位及經(jīng)外奇穴等。鶴頂主治下肢癱瘓、鶴膝風(fēng)等；委中穴對于膝部疼痛有很好療效[29]；段權(quán)等[30]通過研究腧穴的熱敏化規(guī)律發(fā)現(xiàn)陽陵泉、鶴頂穴發(fā)生熱敏化的頻率較高。故本試驗(yàn)選取了鶴頂、陽陵泉、委中穴作為穴位研究對象，并按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[31]取穴。

本實(shí)驗(yàn)在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)鶴頂穴MC數(shù)量和脫顆粒率的變化并不是完全一致的，究其原因可能是隨機(jī)選擇的視野中差異較大，樣本量不夠大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)可適當(dāng)增加樣本量，將這些誤差控制在較小的范圍中。

綜上所述，不同疾病程度的不同穴位在穴位敏化中MC的形態(tài)和功能發(fā)生了變化，MC的募集和脫顆粒率與疾病程度成正相關(guān)，且穴位的敏化具有位置的特異性，這對膝骨關(guān)節(jié)炎的早期臨床診斷和治療有指導(dǎo)意義。本研究證實(shí)穴位發(fā)生敏化時(shí)穴位處的MC釋放了類胰蛋白酶、5-HT、HA物質(zhì)，MC釋放這些物質(zhì)可能是穴位發(fā)生敏化的細(xì)胞分子機(jī)制。