三穴五針對(duì)哮喘大鼠肺組織中Eotaxin、RANTES表達(dá)的影響*

魏 旭，韓君萍，虞躍躍，李 雙，趙 葉，楊金華，崔建美

(華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000)

支氣管哮喘是當(dāng)今社會(huì)常見的慢性疾病之一，是一種以多種炎癥細(xì)胞和一系列細(xì)胞因子參與為特征的氣道慢性炎癥性疾病[1]。臨床表現(xiàn)為呼氣性呼吸困難、反復(fù)發(fā)作性喘息、咳嗽或胸悶等癥狀，每于夜間和(或)清晨發(fā)作。據(jù)世界各國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，目前全球約有3億哮喘患者，其中兒童患病率在3.3%～29%，成人患病率在1.2%～25.5%[2-3]，被世界衛(wèi)生組織列為四大頑癥之一。針刺防治哮喘療效確切，副作用小，費(fèi)用相對(duì)較低，逐漸成為我國(guó)防治哮喘的特色之一。邵氏“三穴五針?lè)ā庇缮劢?jīng)明教授所創(chuàng)，即以雙側(cè)肺俞穴、風(fēng)門穴及單穴大椎為主穴的針刺療法[4-5]，邵氏“三穴五針?lè)ā笔窃诙嗄甑呐R床實(shí)踐與研究中總結(jié)而成的治療方法，在治療哮病的臨床應(yīng)用中效果顯著[6-7]，然而其治療哮喘的作用機(jī)制尚未完全明確[8]。本實(shí)驗(yàn)采用HE染色法、免疫組化法等觀察“三穴五針?lè)ā贬槾虒?duì)支氣管哮喘大鼠肺組織病理改變及Eotaxin、RANTES的影響，以探討“三穴五針?lè)ā敝委熛淖饔脵C(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠30只(購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK2015-0038)，雄性，(120±10)g。大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施(使用證明：MY10DXK07)，溫度設(shè)定20℃～25℃，濕度設(shè)定60%～70%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》(2006)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑和儀器

卵蛋白(A5503-10G，美國(guó)Sigma公司)；兔抗大鼠Eotaxin抗體(A7569，abclonal)；山羊血清(792740，Blological Industries)；兔抗大鼠RANTES抗體(A5630，abclonal)；兔抗大鼠熒光二抗(100944，KPL)；DAPI(035M4029V，SIGMA)；霧化吸入器(085G3005，德國(guó)PARI)；生理記錄儀；切片機(jī)(RM223型，德國(guó)萊卡)；一次性無(wú)菌針灸針(華佗牌)；熒光防淬滅封片劑(150529，KPL)；酶標(biāo)儀(M200PRO，TECAN)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將30只SD大鼠(SPF級(jí))隨機(jī)分為3組，每組各10只，具體分組如下：①正常對(duì)照組：用生理鹽水代替卵蛋白(OVA)；②哮喘模型組：按大鼠哮喘模型制備方法進(jìn)行造模，但不給予針刺處理；③針刺干預(yù)組：自造模之日起采用“三穴五針?lè)ā苯o予針刺處理。

1.3.2 制備哮喘大鼠模型 哮喘模型組及針刺干預(yù)組SD大鼠腹腔注射生理鹽水配制的卵蛋白(OVA)懸液1 mL[含1 mg卵蛋白(OVA)和10 mg Al(OH)3凝膠]，并于第8天重復(fù)注射1次，第9天開始用1%OVA混懸液霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每日1次，激發(fā)4周。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射及霧化吸入相同劑量的生理鹽水，且時(shí)間地點(diǎn)與哮喘模型組保持一致[9]。

1.3.3 “三穴五針?lè)ā贬槾谈深A(yù) 自造模之日起開始針刺，穴位選取大椎、雙側(cè)風(fēng)門和雙側(cè)肺俞，進(jìn)針后予以平補(bǔ)平瀉手法，5 min行針1次(捻轉(zhuǎn)速度200次/min，捻針20次為行針1次)，留針20 min，隔日1次，共針刺4周。

1.3.4 氣道阻力與肺順應(yīng)性測(cè)定 用10%的水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，將氣管和食管切開后插管，然后用數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)連接(上海醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供)記錄供測(cè)定潮氣量(VT)、氣流速率(V)和呼吸頻率。經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像、數(shù)據(jù)分析處理得到氣道阻力(R)和肺順應(yīng)性(C)。

1.3.5 肺組織病理學(xué)觀察 3組大鼠分別檢測(cè)氣道阻力后，迅速結(jié)扎大鼠右肺中葉，右心室頭皮針插管并在左心耳剪開一切口，用無(wú)菌生理鹽水快速行肺循環(huán)灌注至雙肺蒼白色。將心肺和氣管完整取出，剝離肺，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙拭干。剪出結(jié)扎的右肺中葉，進(jìn)行HE染色：4%多聚甲醛固定肺組織標(biāo)本，24 h后清水沖洗過(guò)夜，梯度乙醇脫水、透明，浸蠟組織，石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm厚度)。HE染色后顯微鏡下觀察炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及肺組織結(jié)構(gòu)的病理改變。

1.3.6 免疫組化檢測(cè)肺組織中Eotaxin、RANTES蛋白的表達(dá) 將石蠟切片按以下步驟操作：①65℃烤片機(jī)上烤片40 min，室溫放置5 min；②進(jìn)項(xiàng)常規(guī)石蠟切片脫蠟后，放入純水中2 min；③放入微波爐中高火煮沸后，將玻片放入插槽中，改中火7 min進(jìn)行高溫修復(fù)；取出后室溫30 min冷卻后，PBS洗滌5 min×3次；④H2O2(消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶)放在濕盒中15 min過(guò)PBS 3 min×3；擦片后加入一抗4℃冰箱過(guò)夜；⑤拿出濕盒室溫孵育1 h后，PBS沖洗2 min×3次；⑥加二抗孵育15 min后，PBS沖洗3 min×3次；⑦DAB(純水:試劑A:試劑B：試劑C為20∶1∶1∶1)顯色7 min；⑧用顯微鏡觀察，備一盆水用于終止染色；終止染色后，蘇木素染色3 min后，清水洗2次，鏡下觀察染色情況來(lái)定分化時(shí)間；鹽酸分化10 s后，流水返藍(lán)30 min；⑨梯度酒精脫水，中性樹固封。用Image pro plus6.0軟件測(cè)量IOD值。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，選用Dunnett’S T3法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。各組數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組肺順應(yīng)性和氣道阻力肺順應(yīng)性比較

哮喘模型組氣道阻力較正常對(duì)照組明顯升高(P=0.015<0.05)，針刺干預(yù)組氣道阻力較哮喘模型組明顯降低(P=0.000<0.05)。哮喘模型組肺順應(yīng)性較正常對(duì)照組明顯降低(P=0.012<0.05)，針刺干預(yù)組肺順應(yīng)性較哮喘模型組明顯升高(P=0.047<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠氣道阻力與肺順應(yīng)性測(cè)定比較

注:與哮喘模型組比較，#P<0.05；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與針刺干預(yù)組比較，▲P>0.05

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

經(jīng)HE染色觀察顯示，哮喘模型組大鼠肺組織可見肺泡內(nèi)結(jié)構(gòu)損壞，支氣管黏液水腫，粘液栓形成，管腔變窄，氣道平滑肌肥大增厚，支氣管上皮結(jié)構(gòu)不規(guī)則、細(xì)胞脫落；氣道壁及肺間質(zhì)中大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。針刺干預(yù)組較模型組肺組織炎癥減輕，氣管及肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，管腔內(nèi)偶見分泌物滯留，炎性細(xì)胞少量分布，氣道平滑肌增厚及狹窄顯著好轉(zhuǎn)，與正常對(duì)照組較接近。見圖1。

2.3 各組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES蛋白陽(yáng)性表達(dá)值

哮喘模型組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(均P<0.05)，針刺干預(yù)組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達(dá)水平較哮喘模型組明顯降低(均P<0.05)。見表2、圖2和圖3。

表2 各組大鼠肺組織平均IOD值的比較

注:與哮喘模型組比較，#P<0.05；與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與針刺干預(yù)組比較，▲P>0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×200)注:箭頭所指為氣管

圖2 各組大鼠肺組織Eotaxin表達(dá)

圖3 各組大鼠肺組織RANTES表達(dá)

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)制的分析，大多集中在氣道高反應(yīng)、氣道炎癥及氣道重塑等方面[10]。而對(duì)哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的評(píng)估主要通過(guò)觀察大鼠肺組織氣道阻力及肺順應(yīng)性的變化。氣道阻力主要指氣體通過(guò)呼吸道遇到的摩擦阻力，其變化與管腔的半徑4次方成反比，所以在哮喘發(fā)作支氣管收縮時(shí)，管腔半徑的小變化，就會(huì)導(dǎo)致氣道阻力發(fā)生巨大改變。肺順應(yīng)性是測(cè)定肺的彈力是否正常的一種方法，能夠反映肺的彈性，當(dāng)氣道任一部位發(fā)生狹窄或阻塞時(shí)可使肺順應(yīng)性明顯降低[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組氣道阻力較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，針刺干預(yù)組氣道阻力較哮喘模型組明顯降低(P<0.05)。哮喘模型組肺順應(yīng)性較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05) ，針刺干預(yù)組肺順應(yīng)性較哮喘模型組明顯升高(P<0.05)。說(shuō)明哮喘發(fā)作可致氣道阻力增加、肺順應(yīng)性降低，經(jīng)針刺后可有效改善氣道阻力，增強(qiáng)肺順應(yīng)性從而抑制哮喘支氣管痙攣收縮,降低興奮傳導(dǎo)。

氣道炎癥作為哮喘重要的發(fā)病機(jī)制，與氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切，嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是支氣管哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，它在哮喘氣道的聚集是哮喘發(fā)作的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，大多數(shù)炎性細(xì)胞最終通過(guò)EOS產(chǎn)生效應(yīng)[12]，同時(shí)其在氣道的浸潤(rùn)與活化也決定了哮喘的嚴(yán)重程度[13]。Eotaxin 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的嗜酸粒細(xì)胞趨化因子，由嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，在肺臟內(nèi)主要由支氣管和肺泡上皮產(chǎn)生，其主要化學(xué)作用是吸引EOS在肺內(nèi)的募集，是一種EOS化學(xué)激動(dòng)劑[14]。且Eotaxin 是唯一一個(gè)僅與單一受體CCR-3發(fā)生作用而介導(dǎo)EOS從血管遷移至炎癥肺組織中的趨化因子，趨化嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥部位聚攏，從而引起局部嗜酸性粒細(xì)胞炎癥發(fā)生[15-17]。調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子(RANTES)是第1個(gè)被證實(shí)的具有趨化EOS功能的CC趨化因子，在哮喘的早期和后期對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的趨化起到了重要作用。RANTES主要來(lái)源于淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。有研究證實(shí)RANTES的表達(dá)升高與氣道炎癥的嚴(yán)重程度關(guān)系密切[18]。在氣道炎癥過(guò)程中，RANTES在促進(jìn)EOS從骨髓中釋放的同時(shí)，局部RANTES還可招引EOS聚集于支氣管氣道組織中，激活炎癥細(xì)胞，使炎癥介質(zhì)釋放增加，形成EOS為主的效應(yīng)細(xì)胞形成的氣道炎性病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HE染色鏡下哮喘模型組大鼠肺組織病理改變及炎癥程度明顯，經(jīng)“三穴五針?lè)ā贬槾谈深A(yù)后，上述改變明顯減輕。哮喘模型組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，針刺干預(yù)組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達(dá)水平較哮喘模型組明顯降低(P均<0.05)。以上說(shuō)明，“三穴五針?lè)ā蹦苡行У亟档拖Ｐ痛笫蠓谓M織中Eotaxin、RANTES的含量，減輕氣道炎癥反應(yīng)，從而控制哮喘的發(fā)作。