西黃丸含藥血清對大腸癌細(xì)胞干性標(biāo)志物表達(dá)的影響※

孔婧妍 楊 帆

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301617）

大腸癌作為一種生活中常見的癌癥，給人們帶來了非常嚴(yán)重的危害。在全球所有的癌癥之中，大腸癌發(fā)病率一直居高不下，我國更是大腸癌的高發(fā)地區(qū)，在所有惡性腫瘤病死率中位居第5[1]。因此尋找能夠防治大腸癌的有效藥物并闡明其作用機(jī)制已成為當(dāng)前研究亟待解決的問題。中醫(yī)藥在防治腫瘤方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，已成為抗腫瘤治療的重要組成部分。大腸癌屬本虛標(biāo)實(shí)的虛實(shí)夾雜病證，多與虛、瘀、痰、毒有關(guān)。中醫(yī)治療講究辨證論治，針對有形實(shí)邪，化堅(jiān)活血解毒法在癌癥的治療中顯得十分重要。因此在選擇活血解毒藥物時，更要突出一個軟堅(jiān)散結(jié)的關(guān)鍵功能特點(diǎn)。西黃丸由牛黃、麝香、乳香（醋制）、沒藥（醋制）粉末加黃米飯以水泛丸而成，具有豁痰散結(jié)，解毒消癰之功。該方主要針對痰、瘀、毒邪，即針對大腸癌邪實(shí)的特點(diǎn)進(jìn)行治療，藥簡力專，是治療癰疽疔毒、瘰疬、痰核、流注、癌腫之名方。在臨床抗腫瘤方面，特別是在腫瘤聯(lián)合用藥方面發(fā)揮了重要作用[2-3]。但西黃丸抗大腸癌的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44+／EpCAMhigh的表達(dá)情況，從腫瘤干性細(xì)胞的角度認(rèn)識西黃丸抗大腸癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Wistar雄性大鼠（許可證號：SGXK(津)2014-0001）；西黃丸（天津中新藥業(yè)樂仁堂制藥廠生產(chǎn)）；人大腸癌LoVo細(xì)胞株來源于本實(shí)驗(yàn)保存的細(xì)胞株；1640培養(yǎng)基購自北京邁晨科技有限公司；胎牛血清和雙抗購自Hyclone，0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)購自 Gibco；DMSO、β-巰基乙醇購自Sigma；PBS磷酸鹽緩沖液購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體FITC anti-mouse/human CD44（103021） 和抗體PE anti-human CD326 (EpCAM)（324205） 均購自Biolegend公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西黃丸含藥血清的制備 （1）動物飼養(yǎng)及分組。28只雄性Wistar大鼠置于天津中醫(yī)藥大學(xué)動物房飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食（水和飼料均由天津中醫(yī)藥大學(xué)動物房提供），每只鼠籠最多飼養(yǎng)4只大鼠，以給予充分空間，墊料每日更換一次，室溫17℃～24℃。普通飼養(yǎng)1周后，對大鼠進(jìn)行稱重分組，分為生理鹽水對照組與西黃丸低、中、高劑量組，每組7只。 （2）給藥方式和劑量。將西黃丸分別配制成2.16 g（kg·d）、3.24 g（kg·d）、4.32 g（kg·d） 濃度的懸濁液給予中藥組大鼠灌胃，生理鹽水組予生理鹽水4 mL，2次/d，連續(xù)7 d；于末次灌胃前禁食不禁水12 h，末次灌胃后1 h，采用股動脈取血法，全血采集到無菌離心管內(nèi)。（3）血清制備。全血于4℃靜置，2 h；離心3 000 r/min，15 min，分離上清液；56℃水浴鍋滅活，30 min；0.22 M微孔濾器過濾除菌，分裝于1.5 mL無菌離心管中，每管1 mL，標(biāo)記清楚后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時用1640培養(yǎng)基稀釋至濃度為10%使用。

1.2.2 大腸癌LoVo細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 取凍存的大腸癌LoVo細(xì)胞株，于37℃水浴箱迅速融化；用含10%FBS的1640培養(yǎng)液稀釋；離心1 000 r/min，5 min；棄掉廢液，加入適量新鮮完全培養(yǎng)基，接種到新的培養(yǎng)瓶中；置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日進(jìn)行換液，細(xì)胞到對數(shù)生長期時傳代。傳2～3代后，分為空白對照組、西黃丸低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別加入相應(yīng)含濃度10%鼠血清的培養(yǎng)基；置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。藥物作用48 h后處理細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞分析術(shù)檢測CD44／EpCAM陽性率 去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化處理貼壁細(xì)胞，1640培養(yǎng)基終止消化。細(xì)胞重懸，將細(xì)胞懸液離心后棄上清液，用冰PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.3×106個/mL。取流式上樣管分別加入上述細(xì)胞懸液，分別加入FITC標(biāo)記的CD44抗體和PE標(biāo)記的EpCAM抗體，混勻后，避光染色30 min。PBS洗滌去除未結(jié)合抗體成分后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。重復(fù)以上試驗(yàn)3次，統(tǒng)計(jì)均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，多組間比較單因素方差分析（one-way，ANOVA），方差齊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用LSD-t檢驗(yàn)方法進(jìn)行各組間的比較；方差不齊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Dunnett-T3檢驗(yàn)方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

西黃丸能夠降低大腸癌腫瘤細(xì)胞干性標(biāo)志物CD44+／EpCAMhigh的表達(dá)百分比（圖1）。與空白對照組相比，LoVo細(xì)胞在西黃丸不同劑量的作用下，CD44+/Ep-CAMhigh表達(dá)的陽性率呈降低趨勢 (表1)。其中，中、高劑量組的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。提示西黃丸可能對大腸癌腫瘤干細(xì)胞活性存在抑制作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD44+／EpCAMhigh細(xì)胞百分比

表1 LoVo細(xì)胞中不同組別CD44／EpCAM的陽性率

3 討論

西黃丸（又名犀黃丸）載于 《外科證治全生集》，是中醫(yī)藥治療癌腫之名方，方中以牛黃為君，取其清熱瀉火，豁痰解毒之功；以麝香為臣，取其通諸竅之不利，開經(jīng)絡(luò)之壅塞，活血通絡(luò)之功；乳香、沒藥具破癥結(jié)、散瘀血之效，共為佐藥，輔料黃米飯可調(diào)胃和中，以免諸藥攻邪太過而傷脾胃。現(xiàn)代研究表明西黃丸對多種惡性腫瘤都有抑制作用[4-6]，已廣泛用于惡性腫瘤的治療，臨床療效明顯。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞群體中的一部分特殊的腫瘤細(xì)胞亞群，具有自我更新、無限增殖、多向分化等潛能，在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)EpCAMhigh/CD44+為大腸癌干細(xì)胞重要的表型特征。CD44分子作為一種細(xì)胞粘附分子，與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系[7-8]。EpCAM，又稱CD326，是由GA-733-2基因編碼的40 kd的糖蛋白，是最早被發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物之一[9]。EpCAM參與了信號傳遞、細(xì)胞遷移、增殖以及分化等過程，可在大腸癌組織中表達(dá)且有較高的檢測率，因此可作為臨床檢測大腸癌診斷的生物標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)選擇觀察大腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44+/EpCAMhigh的表達(dá)情況，來推斷西黃丸對大腸癌腫瘤細(xì)胞干性的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測西黃丸含藥血清作用于人體大腸癌LoVo細(xì)胞后，CD44+／EpCAMhigh作為檢測大腸癌腫瘤細(xì)胞干性指標(biāo)，觀察西黃丸不同劑量組與空白對照組相比，CD44和EpCAM雙陽性的細(xì)胞數(shù)量占大腸癌LoVo細(xì)胞數(shù)量的比例變化。結(jié)果表明西黃丸中、高劑量組與空白對照組比較，CD44+/Ep－CAMhigh百分比有下降趨勢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示西黃丸對LoVo細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞活性可能具有抑制作用，這可能是西黃丸防治大腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)手段探析西黃丸抗癌的作用機(jī)制，可以更好地發(fā)揮西黃丸的臨床價值，促進(jìn)傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，為中醫(yī)藥的發(fā)展提供新的空間。