不同提取方式的五倍子對兩種臨床分離耐藥菌的體外抑制作用研究※

耿少輝 程 鳳 陳偉姣 李江波 王 帆 陳夢茹 楊麗萍 魏天貴 呂 越

（1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；4 河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河南 鄭州 450046）

耐藥菌的大量產(chǎn)生增加了臨床患者死亡的危險(xiǎn)性[1-2]，尋求能夠?qū)苟嘀啬退幘奶娲咕幬镆呀?jīng)成為全球關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌是醫(yī)院感染的重要病原菌。近年來其感染在增多，且耐藥性日益嚴(yán)重[3-4]，已引起臨床和微生物學(xué)者的高度關(guān)注。有研究表明五倍子具有良好的抑菌效果[5]。但體外抑菌實(shí)驗(yàn)大部分選用的是敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株，有關(guān)五倍子對耐藥菌抑菌作用的研究相對較少，五倍子是否對臨床分離的多重耐藥菌具有抑菌作用，尚有待研究。五倍子抑菌成分復(fù)雜，各成分穩(wěn)定性差異較大[6]。目前常用的水煎煮、醇提取與超聲提取3種提取方法因提取溶劑與提取方式的不同，是否會(huì)使五倍子提取物的抑菌效果出現(xiàn)差異尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮、醇提取與超聲提取三種方法制備五倍子提取物，并與具有代表性的抗生素進(jìn)行對比，系統(tǒng)研究了五倍子對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用，期望能為臨床用藥劑型的選擇與進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科提供的臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌。詳細(xì)耐藥情況見表1。

表1 臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌耐藥情況

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 五倍子飲片300 g（批號(hào)：161101，購自南陽仲景百信醫(yī)藥科技有限公司）、無水乙醇5 L（批號(hào)：17-011-00015，購自滄州海岳化工有限公司）、牛肉蛋白胨250 g×1瓶（英國OXIOD公司）、瓊脂100 g×1瓶（鄭州安圖生物工程有限公司）、青霉素G藥敏紙片1瓶、慶大霉素藥敏紙片1瓶、磺胺甲惡唑藥敏紙片1瓶（天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平1臺(tái)（OHAUS公司），恒溫水浴鍋和醫(yī)用超聲波清洗機(jī)1臺(tái)（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司）、一次性大號(hào)培養(yǎng)皿（直徑150 mm）30個(gè)（鄭州安圖生物工程有限公司）、生物安全柜1臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、接種環(huán)2個(gè)（萊博生物實(shí)驗(yàn)耗材公司）、恒溫培養(yǎng)箱1個(gè)（天津市泰斯特儀器有限公司）、麥?zhǔn)媳葷醿x1臺(tái)（法國梅里埃生物有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 五倍子提取物的制備 （1）水煎煮法。將五倍子飲片粉碎至過16目篩，稱取50 g，置燒杯中加水浸泡1～2 h，將燒杯放于電熱板，加入400 mL水煎煮30 min。趁熱用8層紗布過濾，濾渣另加300 mL水煎煮20 min。趁熱過濾，合并2次濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中80℃濃縮至50 mL，定容，置于高溫高壓滅菌鍋中滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。（2）醇提取法。水浴鍋溫度設(shè)置為80℃，稱取五倍子粉末20 g加入圓底燒瓶中。取200 mL 80%乙醇加入圓底燒瓶，浸泡1 h后，水浴加熱回流1 h，過濾。濾渣加入160 mL 80%乙醇，再次回流加熱1 h。過濾，合并2次濾液；置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中80℃濃縮，定容至20 mL。高溫高壓滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。（3） 超聲提取法。取25 g五倍子粉末，用250 mL 80%的乙醇浸泡30 min后放入超聲裝置中，50℃，100%功率超聲提取30 min。用八層紗布過濾取上清。殘?jiān)尤?50 mL 80%的乙醇，相同條件提取30 min。過濾。合并2次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80℃濃縮，定容至25 mL，高溫高壓滅菌，即得1 g/mL的五倍子藥液[7]。

1.4.2 培養(yǎng)基的制備 （1）液態(tài)培養(yǎng)基。稱取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解。使用1 mol/L NaOH與1 mol/L的HCl調(diào)試pH至7.6。在1.05 kg/cm2，121 ℃的條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min。將滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中保存24～48 h，觀察是否變渾濁，檢查滅菌是否徹底。（2）固態(tài)培養(yǎng)基。稱取牛肉蛋白胨13 g，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解。再加入25 g瓊脂糖，加熱溶化。使用1 mol/L NaOH與1 mol/L的HCl調(diào)試PH至7.6。相同條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min。待培養(yǎng)基溫度冷卻到50℃左右時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基均勻倒入無菌平板，厚度控制在4 mm。將滅菌后的培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中保存24～48 h，觀察是否變渾濁，檢查滅菌是否徹底。

1.4.3 菌株復(fù)蘇 將檢測后的細(xì)菌在固態(tài)培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)菌落用生理鹽水配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫龋ㄏ喈?dāng)于108 CFU/mL）菌液。

1.4.4 制作無菌小紙片 將打孔器制成的小紙片（直徑為5 mm） 放入培養(yǎng)皿中，高壓 (表壓：0.7 kg/cm2，溫度：115℃，時(shí)間：30 min)滅菌，取出放涼，即得實(shí)驗(yàn)用的無菌小紙片。

1.4.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，使用接種環(huán)將0.5麥?zhǔn)蠞岫染壕鶆蛲坎加诠腆w培養(yǎng)基上。實(shí)驗(yàn)分為7組，即水煎組、醇提組、超聲提取組、青霉素組、慶大霉素組、磺胺甲惡唑組與陰性對照組，每組均設(shè)置6個(gè)無菌小紙片，均勻放置于培養(yǎng)基上。用校準(zhǔn)過的加樣槍加1 g/mL中藥水煎劑溶液10 μL于無菌小紙片，其余各組以同樣的方法分別加入等量的醇提取劑與超聲提取劑。將培養(yǎng)皿于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測量各抑菌環(huán)直徑。

1.4.6 觀測指標(biāo) 抑菌環(huán)直徑：用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑，抑菌環(huán)的判斷依據(jù)參照國內(nèi)同類型的實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)作為結(jié)果：抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，＜10 mm為不敏感[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用SPSS 21.0進(jìn)行采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方式的五倍子對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌抑制效果的比較 培養(yǎng)24 h后，3種提取方法的五倍子提取物對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌強(qiáng)度為中度敏感。抑菌環(huán)直徑對比結(jié)果顯示，不同提取方式的五倍子對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌抑制效果的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 3種五倍子提取物對兩種耐藥菌抑制效果的比較（x±s）

2.2 不同提取方式的五倍子與3種抗生素對兩種耐藥菌抑制效果的比較 對于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，五倍子提取物的抑菌環(huán)直徑均大于青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑的抑菌環(huán)直徑，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。對于多重耐藥金黃色葡萄球菌，五倍子提取物抑菌效果均優(yōu)于青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 五倍子提取物與3種抗生素對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果比較 （x±s）

表4 五倍子提取物與3種抗生素對多重耐藥金黃色葡萄球菌抑制效果的比較 （x±s）

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種常用的提取方法提取的五倍子提取物對于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，藥敏紙片法顯示抑菌效果呈中度以上敏感?；前芳讗哼蜃鳛榭咕帟r(shí)具有抗菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)的特點(diǎn)，對葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果突出。青霉素G主要對革蘭氏陽性菌有效。慶大霉素是常用的氨基糖苷類抗生素，主要用于革蘭氏陰性菌引起的感染。本研究發(fā)現(xiàn)五倍子提取物對于多重耐藥菌的抑菌效果與青霉素G、慶大霉素、磺胺甲惡唑相比具有明顯優(yōu)勢。提示五倍子中含有可以抑制耐藥菌的有效成分，可為進(jìn)一步從五倍子中篩選抗耐藥菌的有效抑菌成分提供依據(jù)。

本研究選用臨床與實(shí)驗(yàn)室常用的3種提取方式：水煎煮、醇提取與超聲提取[9]。結(jié)果顯示：3種提取方式對于五倍子抑菌效果的影響差異不大，均可以提取出五倍子的有效抑菌成分。

制備過程中發(fā)現(xiàn)水煎煮提取濃縮后的藥液較為濃稠渾濁且不易過濾，而醇提取與超聲提取所獲得的藥液則較為清澈。出現(xiàn)這種差異的原因可能與溶劑的選取有關(guān)，用水提取會(huì)將淀粉、多糖等水溶性物質(zhì)混入到藥液中，導(dǎo)致藥液黏稠渾濁，而采用乙醇作為溶劑時(shí)可以有效濾除水溶性雜質(zhì)，提高藥液的純度。抑菌實(shí)驗(yàn)顯示3種提取方式的提取物抑菌效果差異不大，如對藥液澄清度有一定要求可以選用乙醇作為溶劑進(jìn)行提取。超聲提取具有時(shí)間短、操作簡便的特點(diǎn)，本研究證明了超聲提取可以使藥物中的有效成分在較低溫度下溶出，要求藥物提取溫度較低時(shí)可以選用該方法。

本研究結(jié)果顯示不同提取方式的五倍子對2種耐藥菌的抑菌效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與張莉等[10]的報(bào)道結(jié)果不一致：醇提取優(yōu)于水煎煮。原因可能有以下幾方面：（1）實(shí)驗(yàn)菌株的選擇：本研究選用的為臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌與金黃色葡萄球菌，選取的臨床菌具有很強(qiáng)的耐藥性。以往的研究多為普通菌株或耐藥性較弱的敏感菌株，細(xì)菌的耐藥性弱，對抗菌藥物更加敏感。（2）制備工藝與流程：李學(xué)林等[11]證明不同的煎煮方法對中藥煎液的質(zhì)量影響較大。而水煎煮、醇提取與超聲提取3種常用的提取方法缺少統(tǒng)一的提取規(guī)范與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)研究所選擇的提取條件均存在差異，故提取條件的差異也會(huì)在一定程度上影響著藥物的抑菌效果。多項(xiàng)研究表明五倍子中含有鞣酸，沒食子酸等多種抑菌成分，對多種細(xì)菌均具有一定的抑制作用。本研究亦證明了五倍子對多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用。中藥由于成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[12]。因此需進(jìn)一步開展五倍子等具有抗菌作用的中藥的研究，并對五倍子的抑菌成分進(jìn)行分離與檢測，研究五倍子對耐藥菌的作用機(jī)制，從而為臨床用藥與新型抗菌藥物的研發(fā)提供依據(jù)與方向。