梔子及其復(fù)方梔子豉湯長期用藥潛在安全風(fēng)險研究及建議

文/田婧卓 通訊作者/梁愛華 易艷 趙雍 李春英 張宇實 韓佳寅 劉素彥 鮮中 李桂琴 王連嵋

梔子是茜草科植物梔子的果實，臨床上應(yīng)用廣泛，屬于衛(wèi)生部門頒布的第一批藥食兩用資源。梔子的主要化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜苷類梔子苷、梔子苷酸，二萜類西紅花苷和藏紅花酸、黃酮類梔子素、有機酸酯類綠原酸及梔子苷的水解產(chǎn)物京尼平[1]。梔子的藥理作用主要包括保肝利膽，對急慢性肝損傷[2，3]、膽汁淤積性肝損傷[4]、非酒精性脂肪肝炎[5]、肝纖維化及肝癌[6]均有明顯的治療作用，此外還有抗炎、治療神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、心腦血管疾病的作用[7]。梔子苷是梔子的主要活性成分[8]，在某些情況下也可能造成一定的肝損傷[9]。前期研究表明，大鼠長時間灌胃給予梔子苷（梔子苷100 mg/kg，連續(xù)用藥6個月）可引起一定程度的肝腎損傷。由于梔子苷僅為梔子的成分之一，臨床并不使用梔子苷，而是使用梔子或含梔子的復(fù)方，因此有必要研究梔子以及含梔子的復(fù)方是否會產(chǎn)生與梔子苷類似的潛在毒性，為臨床用藥提供安全性信息。

本研究采用梔子苷、梔子水提物和含梔子復(fù)方平行對比進行大鼠灌胃給藥6個月加停藥1個月的長期毒性實驗，重點考察對肝腎的潛在毒性。梔子水提物和復(fù)方均以梔子苷調(diào)整為同等劑量。復(fù)方采用梔子豉湯。該方由梔子和淡豆豉組成，出自《傷寒論》，是清宣郁熱除煩的經(jīng)典方。淡豆豉有健胃助消化、抗癡呆、抗氧化、抗自由基和保護心血管的作用[10]。現(xiàn)代研究表明，梔子豉湯具有清熱除煩作用，臨床用來治療抑郁癥[10]。抑郁癥是一種慢性疾病，在治療過程中需要長期用藥以保證治療效果。因此，本研究以梔子豉湯為復(fù)方代表進行大鼠長期用藥的潛在毒性觀察。

1.材料

1.1 供試品

梔子苷（批號：S140807），HPLC法測定含量為97.122%，購于北京賽白草科技有限公司。使用時現(xiàn)用現(xiàn)配，用純凈水配制。梔子（批號：140113008），HPLC法測定原藥材中梔子苷的含量為5.675%，購于北京仟草中藥飲片有限公司。采用常規(guī)水煎法制備梔子水提物（北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所制備），濃縮為棕黑色膏狀，梔子苷含量為8.7258%，用純凈水稀釋后灌胃用。淡豆豉（批號：140227001），購于北京仟草中藥飲片有限公司。梔子豉湯制備：采用梔子∶淡豆豉=1∶1混合，采用水煎法制備為棕黑色膏狀。梔子豉湯中梔子苷的含量為4.0365%。

1.2 動物

健康SPF級SD大鼠160只，雌雄各半，6～7周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001，合格證號：11400700099088。動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心動物房，采用人工光照，屏障系統(tǒng)，12小時明暗交替，換氣次數(shù)不少于15次/h，室內(nèi)溫度控制在20～26℃，濕度為40%～70%，自由設(shè)施飲水，每籠5只。所有大鼠檢疫適應(yīng)5天后進行實驗。本實驗由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)，依照實驗動物應(yīng)用倫理準(zhǔn)則進行實驗，實驗的相關(guān)步驟均遵照此規(guī)定。

1.3 儀器

動物天平（Sartorius），全自動生化分析儀（Toshiba），尿液分析儀（Simens Clinitek），血凝儀（普利生），全自動血液分析儀（Simens），電解質(zhì)分析儀（Medica），光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus），全自動脫水機（Shandon），石蠟包埋機（Microm），石蠟切片機（Thermo），全自動染色機（Microm），高速冷凍離心機（sigma）等。

2.實驗方法

2.1 分組及給藥

將SD大鼠隨機分成4組：對照組、梔子苷（geniposide）50 mg/kg組、梔子水提物（AEFG）573 mg生藥/kg組、梔子豉湯（GSPD）1.239 g生藥/kg組。除對照組外，其他三組的梔子苷劑量相等（50 mg/kg）。每組40只動物，雌雄各半。對照組灌胃給予純凈水。其他組分別給予不同的藥物，每日給藥1次，連續(xù)給藥，最長周期為6個月。分別于給藥1、3、6個月結(jié)束時，各組分別處死雌性和雄性各5只動物，收集各種生物樣本。各組其余動物于停藥恢復(fù)1個月后再處死。各時間點的生物樣本和檢測分析按照以下“2.2觀察及檢測指標(biāo)”中描述的方法進行。

2.2 觀察及檢測指標(biāo)

每周稱取1次未禁食體重和攝食量，于給藥前后及恢復(fù)期觀察大鼠的一般狀態(tài)（動物外觀、行為活動、神態(tài)步態(tài)、尿液糞便等）。

給藥1、3、6個月和恢復(fù)期結(jié)束時，用大鼠代謝籠收集尿液，進行尿液常規(guī)檢查（尿量、pH值、比重、葡萄糖、尿蛋白、膽紅素、尿膽原、酮體、潛血、亞硝酸鹽、白細(xì)胞）。各時間點抽取血液，進行血液學(xué)檢測（血紅蛋白、紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)、血小板相關(guān)指標(biāo)等）；凝血指標(biāo)檢測（凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間）；血液生化學(xué)檢測（天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶、總膽固醇、總膽紅素、5' -核苷酸、肌酐、尿素氮等），電解質(zhì)檢測（鈉、鉀、氯）。解剖并摘取臟器稱重，計算臟器指數(shù)（心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、胸腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮）。此外，還摘取了胃、大小腸、垂體、氣管食管、甲狀腺、胰腺、唾液腺、前列腺、膀胱、脊髓、胸骨等臟器或組織，進行病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

體重、攝食量、血液生化學(xué)、臟器指數(shù)、尿量、血液學(xué)、凝血指標(biāo)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差統(tǒng)計；尿常規(guī)分析應(yīng)用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney' s U檢驗方法。比較各給藥組與對照組之間的差異，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異有顯著性。

3.實驗結(jié)果

3.1 梔子苷、AEFG、GSPD對動物一般狀況無明顯影響

圖1 大鼠灌胃給予AEFG后肝臟中由于藥物成分蓄積而呈現(xiàn)為墨綠色（腎臟情況類似，梔子苷和GSPD組與AEFG組類似）

對照組和梔子苷、AEFG、GSPD各給藥組動物在實驗期間均未見死亡，一般狀況好，外觀、行為活動、神態(tài)步態(tài)和糞便均未見異常。三個給藥組的動物體重和攝食量與對照組比較均無明顯差異（數(shù)據(jù)未列示），提示藥物對體重增長和食量無明顯影響。梔子苷組尿液顏色加深呈棕色和黃綠色；AEFG和GSPD組均呈綠色和墨綠色。

3.2 長期用藥后可造成肝臟和腎臟藥物蓄積并導(dǎo)致肝腎損傷

給藥3個月后，梔子苷組、AEFG組和GSPD組的肝臟和腎臟顏色均加深，呈現(xiàn)綠染現(xiàn)象，給藥6個月后更明顯，肝腎均呈墨綠色，對照組和AEFG組的肝臟顏色見圖1。停藥1個月后，肝、腎綠染情況明顯好轉(zhuǎn)，顏色基本恢復(fù)正常。

給藥1個月后雌性大鼠AEFG組的肝指數(shù)和腎指數(shù)顯著升高。給藥3個月后雄性大鼠梔子苷組、AEFG組和GSPD組的肝指數(shù)均顯著高于對照組，其他各給藥時間點的臟器指數(shù)未見異常改變?；謴?fù)期結(jié)束后雄性大鼠各組之間的脾指數(shù)和肺指數(shù)有顯著差異，而雌性大鼠梔子苷的腎指數(shù)顯著降低。除上述變化之外，各給藥組的心臟、肺、腦、胸腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮器官指數(shù)與對照組無顯著差異。圖2顯示的是不同時間點有統(tǒng)計學(xué)顯著性的肝腎指數(shù)結(jié)果。

圖2 梔子苷、AEFG和GSPD對大鼠肝臟和腎臟指數(shù)的影響。數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，n=5

顯微鏡檢查可見，給藥1個月和3個月后，各給藥組雌性和雄性動物的肝臟組織與對照組比較無顯著異常。給藥6個月后，梔子苷組、AEFG和GSPD各給藥組雌、雄大鼠的肝細(xì)胞漿內(nèi)均可見藥物顆粒沉積，彌漫性分布，以中央靜脈周圍更明顯，有的動物伴有輕度至中度膽管增生，其中AEFG組膽管增生明顯（5只雄性大鼠中有3只達到中度膽管增生）。此外，GSPD組1/5只雄性大鼠的肝組織中可見類肉芽腫，見圖3和表1。雌性AEFG組3/5只動物可見肝細(xì)胞核固縮，梔子苷組1/5只動物有類似改變，見表1，雌性大鼠肝組織異常程度略低于雄性。停藥1個月后，各給藥組肝細(xì)胞內(nèi)藥物沉積顆粒明顯減少。

梔子苷組、AEFG和GSPD各組給藥1個月和3個月，各組腎臟組織結(jié)構(gòu)與對照組比較無顯著異常。但給藥6個月后各給藥組雌、雄大鼠腎組織均可見異常改變，包括腎小管腫脹、上皮細(xì)胞脫落、炎性細(xì)胞浸潤、管腔內(nèi)見滲出。此外，各給藥組雌性和雄性大鼠的腎小管細(xì)胞內(nèi)均可見棕色的藥物顆粒沉積，其中，雌性大鼠梔子苷組和AEFG組各有3/5只大鼠可見較多的顆粒樣物質(zhì)沉積，見圖4和表1。此外，雄性大鼠GSPD組有1/5只大鼠腎臟組織可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，見表1，雄性大鼠腎組織異常程度略低于雌性。停藥1個月后，各給藥組腎小管細(xì)胞內(nèi)藥物沉積顆粒明顯減少。圖3和圖4顯示的是代表性肝臟和腎臟病理形態(tài)變化。

除肝腎組織外，各給藥組的其他臟器或組織心臟、肺、腦、脾臟、胃、大腸、小腸、垂體、氣管、食管、甲狀腺、胰腺、唾液腺、前列腺、膀胱、脊髓等未見明顯病理變化。

表1 給予梔子苷、AEFG和GSPD 6個月后雌雄大鼠肝臟和腎臟的異常病理表現(xiàn)的數(shù)量（n=5）

續(xù)表

圖3 大鼠灌胃給予梔子苷、AEFG和 GSPD 6個月后對肝臟組織形態(tài)的影響。

圖4 大鼠給予梔子苷、AEFG和GSPD 6個月后對腎臟組織形態(tài)的影響

A：雄性γ-GT；B：雄性BUN；C：雄性TBiL；D：雌性TBiL＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，與對照組相比 ；#P＜0.05，與梔子苷組相比 ；&&P＜0.01，與 AEFG 組相比

3.3 血液生化學(xué)結(jié)果

梔子苷、AEFG和GSPD給藥1個月和3個月后，各給藥組總膽紅素（TBiL）明顯降低，與梔子的藥效有關(guān)。雄性大鼠給藥3個月后梔子苷組的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（γ-GT）顯著升高。除此之外，三個給藥組給藥3個月后其他生化檢測結(jié)果均未見明顯異常。給藥6個月后，GSPD組雄性大鼠的γ-GT和尿素氮（BUN）較對照組顯著升高（P＜0.05），見圖5 A和B,但γ-GT和BUN的上升幅度有限，TBiL結(jié)果顯著降低（圖5 C和D，P＜0.01）。停藥后1個月，各給藥組血液生化學(xué)指標(biāo)未見異常。

3.4 尿液和血液學(xué)分析

尿液學(xué)分析結(jié)果顯示，給藥1個月和3個月后，各給藥組與對照組相比無顯著差異。給藥6個月后，梔子苷組雄性大鼠的尿液膽紅素（BIL）和雌性大鼠的BIL和尿膽原（URO）與對照組相比有顯著增高（P＜0.05）。AEFG組雄性和雌性大鼠的URO、BIL和雄性大鼠的亞硝酸鹽、雌性大鼠的酮體（KET）與對照組相比有顯著增高（P＜0.01）。GSPD組的雌雄動物的BIL、URO和尿蛋白（PRO）顯著增高（P＜0.05）?；謴?fù)期結(jié)束后，各給藥組與對照組相比均無顯著差異。由于各給藥組的尿液受藥物的影響而顏色明顯加深，因此不能排除尿液中藥物顏色對上述尿液指標(biāo)分析的干擾和影響。

血常規(guī)分析結(jié)果顯示，給藥6個月后，梔子苷、AEFG、GSPD組雌性動物網(wǎng)織紅細(xì)胞比例較對照組顯著增高。除此之外，梔子苷、AEFG、GSPD各給藥1、3、6個月后雌、雄大鼠雖然有少數(shù)血液學(xué)指標(biāo)與對照組比較具有顯著差異，但各項血液學(xué)指標(biāo)值均在正常范圍波動，不認(rèn)為有毒理學(xué)意義。

4. 討論

4.1 含梔子的藥物長期用藥可造成蓄積性肝腎損傷，臨床不宜長期用藥

梔子在中成藥中應(yīng)用廣泛，主要用于實熱、火毒壅盛、濕熱黃疸等，用于這些目的時通常用藥時間較短。然而，由于梔子有清熱除煩功效，目前梔子在臨床上也被用于治療慢性肝炎、抑郁癥和糖尿病等慢性疾病[7,10,11]。臨床發(fā)現(xiàn)，病人如果服用含有梔子的中成藥時間稍長（3個月左右），可見皮膚深染發(fā)綠現(xiàn)象。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)梔子苷、AEFG和含梔子的復(fù)方GSPD長期用藥后，均可見藥物成分在肝、腎組織中蓄積，肉眼可見肝腎顏色變深，呈現(xiàn)綠色或墨綠色；顯微鏡下可見肝臟細(xì)胞、腎小管細(xì)胞胞質(zhì)中有彌漫性藥物顆粒沉積，同時造成一定的肝、腎細(xì)胞損傷，其中藥物沉積量多的細(xì)胞病變更為明顯。而血液生化分析顯示肝腎功能相關(guān)的指標(biāo)除了γ-GT和BUN升幅有限的增高外，其他指標(biāo)并無顯著異常。結(jié)果提示，常規(guī)的血液生化指標(biāo)檢測可能無法準(zhǔn)確預(yù)測梔子及其復(fù)方的肝腎損傷。本實驗中AEFG、GSPD和梔子苷組均設(shè)計為相同的梔子苷劑量，三個給藥組具有劑量可比性，以便于客觀比較三者的毒性反應(yīng)。梔子在臨床上的日用量為6～10 g，《中國藥典》2015年版規(guī)定梔子中梔子苷的含量不得小于1.8%[8]，而市面上梔子中梔子苷的最高含量可達6%。以梔子苷含量中位水平4%計算，大鼠服用梔子苷50 mg/kg相當(dāng)于人（60 kg體重）服用梔子劑量為11 g生藥，接近臨床劑量。本研究提示，即使是采用梔子的臨床劑量，如果長期用藥也可能造成藥物蓄積，并造成肝腎毒性。因此，臨床上使用含梔子的藥物時應(yīng)注意用藥時間不宜過長。

4.2 梔子的肝腎毒性與梔子苷有關(guān)

本實驗室以往的研究已經(jīng)報道過梔子苷過高劑量或者長期用藥均可造成肝腎毒性，其毒性表現(xiàn)與本研究類似。本研究采用梔子苷、AEFG、GSPD平行設(shè)計，三組的劑量按照梔子苷計均相同（50 mg/kg），三組給藥6個月后肝臟和腎臟均發(fā)生了明顯的藥物蓄積，同時部分肝腎組織有毒性表現(xiàn)。其中梔子苷組和AEFG組在肝腎細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積以及組織損傷上雖有微弱差異，但是基本類似和相近，說明梔子產(chǎn)生的藥物蓄積主要是梔子苷引起的，其肝腎毒性可能與梔子苷有關(guān)，這個與以往的報道相類似[9]。GSPD組的肝腎損傷作用與另外兩組相比程度明顯較低，提示梔子復(fù)方中的配伍應(yīng)用可能有助于減輕梔子苷的肝腎毒性作用，這與前期研究結(jié)論相類似[12]。

4.3 《中國藥典》關(guān)于梔子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)增加梔子苷最高限量和不宜長期用藥的提示

本研究顯示，大鼠給予梔子苷、AEFG、GSPD 1個月和3個月肝腎組織損傷尚不明顯，而長期用藥6個月出現(xiàn)了肝腎毒性。結(jié)果提示:在一定的劑量下將給藥時間限定在一定范圍內(nèi)可能相對安全。由于梔子藥材中梔子苷含量范圍差異較大，我們從市場購買的梔子的梔子苷含量接近6%，相當(dāng)于《中國藥典》2015年版規(guī)定的梔子苷限量標(biāo)準(zhǔn)（1.8%）的3倍余。前期研究我們發(fā)現(xiàn)梔子苷過高劑量即便是短期使用時也可造成肝臟和腎臟毒性。因此，根據(jù)本研究，我們建議《中國藥典》中梔子的【含量測定】項下，不僅對梔子苷的最低含量做出規(guī)定，還需要對梔子苷的最高含量制定限量標(biāo)準(zhǔn)，以降低可能攝入過量的梔子苷而導(dǎo)致肝腎毒性的風(fēng)險。另外，為了避免長期用藥產(chǎn)生毒性，應(yīng)在【用法與用量】項下增加“不宜長期用藥”。

4.4 建議將梔子從《既是食品又是藥品的物品名單》中移除

除了在藥品中使用外，梔子被列于《既是食品又是藥品的物品名單》上，因此其在食品和保健食品中的應(yīng)用越來越廣泛。據(jù)統(tǒng)計，含有梔子的保健品有70余個，涉及保健功能有18種，包括對化學(xué)性肝損傷有輔助保護作用、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、祛痤瘡、改善睡眠、輔助降血脂等。作為食品和保健品應(yīng)用時，長期食用的可能性較大。由于人們通常認(rèn)為食品與保健品具有較高的安全性，因此服用劑量和使用時間隨意性較大。鑒于梔子的蓄積性相對比較明顯，長期用藥具有潛在風(fēng)險，建議將梔子從《既是食品又是藥品的物品名單》中去除。