國產(chǎn)兩性霉素B及其他常用抗真菌藥物對(duì)侵襲性真菌病病原菌的體外抑菌活性研究

周亞彬 王千 張浩 萬喆 李若瑜 劉偉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

近年來，不斷有新的侵襲性真菌病的致病菌種被發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌等少見真菌感染導(dǎo)致的侵襲性真菌病也在逐漸增加[1]。雖然近年來新型抗真菌藥物不斷問世，但其種類仍然較少，臨床上治療侵襲性真菌病仍然存在諸多困難[2]。兩性霉素B(amphotericin B，AMB)是一個(gè)經(jīng)典的廣譜抗真菌藥物，自1959年上市以來，一直在侵襲性真菌感染中發(fā)揮著重要治療作用[3]。但有關(guān)該藥的藥效學(xué)，特別是對(duì)于國內(nèi)近年來臨床分離的病原真菌體外抗菌活性則缺乏最新的研究資料，影響了臨床用藥的選擇。本研究采用國產(chǎn)AMB與當(dāng)前臨床常用的治療侵襲性真菌感染的抗真菌藥物進(jìn)行比較，觀察它們對(duì)我國臨床分離的念珠菌、隱球菌、曲霉、毛孢子菌、賽多孢菌、毛霉等病原真菌的體外抗菌活性。同時(shí)還將側(cè)重于觀察AMB對(duì)于唑類藥物耐藥的曲霉和念珠菌的體外抗菌活性，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試菌

108株受試菌株系北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科真菌室、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分離自臨床侵襲性真菌病患者，其中包括念珠菌41株 (白念珠菌15株、近平滑念珠菌5株、熱帶念珠菌4株、光滑念珠菌5株、克柔念珠菌1株、西木龍念珠菌4株、葡萄牙念珠菌3株、季也蒙念珠菌3株、解脂念珠菌1株)，曲霉菌38株 (煙曲霉15株、黃曲霉8株、構(gòu)巢曲霉5株、黑曲霉5株、土曲霉5株)，隱球菌7株 (新型隱球菌5株、羅倫隱球菌2株)，毛孢子菌4株 (阿薩希毛孢子菌3株、Trichosporonloubieri1株)，賽多孢菌4株 (多育賽多孢菌1株，尖端賽多孢菌3株)，毛霉9株 (不規(guī)則毛霉2株、卷枝毛霉1株、凍土毛霉1株、傘枝橫梗霉1株、米根霉3株、小孢根霉1株)，茄病鐮刀菌2株，馬爾尼菲籃狀菌3株。克柔念珠菌 (ATCC 6258)、近平滑念珠菌 (ATCC 22019)、黃曲霉 (ATCC 204304) 為藥敏試驗(yàn)用質(zhì)控菌株。

1.2 受試藥物

所有藥物均以原料粉形式提供，AMB由華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)YAN1607201，純度96.3%；氟康唑 (fluconazole，F(xiàn)LC)由Sigma-Aldrich公司提供，批號(hào)200606040，純度為98.93%；伊曲康唑 (itraconazole，ITR)由華中海威基因科技有限公司提供，批號(hào)6122910188，純度99%以上；伏立康唑 (voriconazole，VRC)由山東省壽光富康制藥公司提供，批號(hào)070724，純度99.3℅；泊沙康唑 (posaconazole，POS)由華中海威基因科技有限公司提供，批號(hào)6502P126，純度99%以上；卡泊芬凈 (caspofungin，CAS)由華中海威基因科技有限公司提供，批號(hào)61205C0120，純度99%以上；米卡芬凈 (micafungin，MCF)由華中海威基因科技有限公司提供，批號(hào)1026B410，純度99%以上。

1.3 體外抑菌活性測定

方法 酵母菌和絲狀真菌的最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)或最低有效濃度 (minimum effect concentration,MEC)測定，分別參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的M27-A3[4]和M38-A2[5]方案進(jìn)行。

培養(yǎng)基選擇 按照CLSI方案要求采用RPMI-1640液體培養(yǎng)基。

藥物儲(chǔ)存液制備與儲(chǔ)存 抗真菌藥物按照溶解性分別采用二甲基亞砜 (DMSO)或蒸餾水溶解，獲得相應(yīng)濃度 (包括各藥物的折點(diǎn)和質(zhì)控菌株對(duì)該藥物MIC范圍)的儲(chǔ)存液。新鮮配制的儲(chǔ)存液分裝到無菌的聚丙乙烯小管，密封儲(chǔ)存于-70℃。

藥敏板配置 實(shí)驗(yàn)前采用相應(yīng)液體培養(yǎng)基稀釋至2倍終濃度工作液。ITR、VRC、POS、AMB、CAS、MCF最終濃度范圍為0.03～16 mg/L，F(xiàn)LC最終濃度范圍為0.125～64 mg/L。將稀釋的藥物按照濃度由高到低依次加入微量藥敏板 (96孔酶標(biāo)板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分別加入100、200 μL相應(yīng)液體培養(yǎng)基 (藥物采用DMSO稀釋者含同濃度的DMSO)，分別作為生長對(duì)照和空白對(duì)照，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌懸液制備及接種 將受試酵母菌分離株轉(zhuǎn)種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)生長24～72 h，雙相真菌馬爾尼菲籃狀菌采用致病相酵母相進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參考文獻(xiàn)[6-7]，轉(zhuǎn)種于腦心浸液瓊脂 (brain heart infusion，BHI)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，每7 d傳代1次，直至70%以上細(xì)胞轉(zhuǎn)化為酵母樣細(xì)胞。用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，先用液體培養(yǎng)基稀釋菌液20倍，再稀釋50倍其菌含量為 (1～5)×103CFU/mL，對(duì)于馬爾尼菲籃狀菌用液體培養(yǎng)基稀釋菌液100倍其菌含量為 (1～5)×104CFU/mL。在96 孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (0.5～2.5)×103CFU/mL，對(duì)于馬爾尼菲籃狀菌最終菌濃度為 (0.5～2.5)×104CFU/mL。絲狀真菌菌株轉(zhuǎn)種于PDA培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)生長2～7 d。用無菌生理鹽水洗脫純化的菌落 (曲霉菌制備菌懸液時(shí)可加入1%吐溫-20)，制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整菌懸液濃度至 (1～5)×106CFU/mL，再用液體培養(yǎng)基稀釋菌液50倍其菌含量為 (2～10)×104CFU/mL。在96孔板中1～11列每孔加入菌液100 μL，使其最終菌濃度為 (1～5)×104CFU/mL。

孵育與結(jié)果判讀 將接種后的藥敏培養(yǎng)板培養(yǎng)一定時(shí)間后 (酵母菌置于35℃恒溫培養(yǎng)24～72 h，絲狀真菌置于35℃恒溫培養(yǎng)21～74 h，馬爾尼菲籃狀菌置于37℃恒溫培養(yǎng)72 h)，觀察結(jié)果。按照CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀，讀取MIC或MEC值。只有當(dāng)生長對(duì)照生長良好且質(zhì)控菌株MIC/MEC值在規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，方認(rèn)為試驗(yàn)成功，可進(jìn)行結(jié)果判讀。所有試驗(yàn)均做2次，同一菌株MIC/MEC值在2次試驗(yàn)不超過2個(gè)稀釋度時(shí)認(rèn)為相同。FLC、VRC、CAS和MCF對(duì)念珠菌的折點(diǎn)為M27方案的補(bǔ)充材料S4制定的折點(diǎn)[8]，其余菌株與藥物無相應(yīng)折點(diǎn)，僅判讀MIC或MEC值。

2 結(jié) 果

因菌株數(shù)不足5株時(shí)，無法計(jì)算GM、MIC/MEC50及MIC/MEC90，故只統(tǒng)計(jì)MIC/MEC范圍。AMB及其他6種抗真菌藥物對(duì)108株侵襲性真菌病致病菌的MIC/MEC值結(jié)果見表1 (菌株數(shù)≥5株)及表2 (菌株數(shù)<5株)。

表17種抗真菌藥對(duì)侵襲性真菌病致病菌的MIC/MEC及GM (mg/L)

Tab.1MIC/MEC&GM values of seven antifungal agents against isolates caused invasive fungal infection

菌種數(shù)目藥物MIC/MEC范圍50%90%GM白念珠菌15AMB0.5-1110.912FLC0.125->6416>643.647ITR0.06-20.520.455VRC0.03-0.50.030.50.064POS0.03-0.1250.060.060.048CAS0.06-0.250.1250.250.164MCF0.03-0.250.030.030.035近平滑念珠菌5AMB1111FLC0.125-0.50.250.50.25ITR0.25-10.510.5VRC0.030.030.030.03POS0.03-0.1250.030.1250.046CAS0.125-20.2520.435MCF1111光滑念珠菌5AMB0.5-1110.871FLC16->6432>6427.858ITR0.5-4141.516VRC0.06-20.0620.212POS0.03-0.50.250.50.216CAS0.125-0.250.250.250.218MCF0.030.030.030.03新生隱球菌5AMB0.25-20.520.66FLC1-4242.297ITR0.25-10.510.435VRC0.03-0.1250.060.1250.053POS0.125-10.2510.287CAS16->1616>16>16MCF16->16>16>16>16煙曲霉15AMB1-2121.382FLC>64>64>64>64ITR0.5->161>162VRC0.5->16120.955POS0.125->160.2510.315CAS0.03-0.1250.060.1250.050MCF0.030.030.030.03

黃曲霉8AMB1-2221.542FLC>64>64>64>64ITR0.25-40.540.648VRC0.125-8180.841POS0.25-0.50.250.50.273CAS0.03-10.510.207MCF0.030.030.030.03黑曲霉5AMB0.125-10.510.379FLC>64>64>64>64ITR1-2121.149VRC0.25-2120.66POS0.06-0.250.1250.250.142CAS0.03-0.1250.060.1250.060MCF0.030.030.030.03土曲霉5AMB2-4242.297FLC>64>64>64>64ITR0.5-1110.871VRC0.125-0.50.250.50.25POS0.125-0.250.1250.250.165CAS0.06-0.1250.1250.1250.093MCF0.030.030.030.03構(gòu)巢曲霉5AMB1-2121.149FLC>64>64>64>64ITR1-2121.149VRC0.25-2120.66POS0.06-0.250.1250.250.142CAS0.030.030.030.03MCF0.030.030.030.03

由表1可以看出AMB對(duì)受測的白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉等的MIC值均≤2 mg/L，但對(duì)土曲霉的MIC值范圍為2～4 mg/L。同時(shí)AMB對(duì)耐唑類藥物的白念珠菌、光滑念珠菌、煙曲霉及黃曲霉MIC值均≤2 mg/L；FLC對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌的MIC值范圍分別為0.125～>6、0.125～0.5、16～>64、1～4 mg/L。FLC對(duì)受試的曲霉MIC值均>64 mg/L。ITR對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC值范圍分別為0.06～2、0.25～1、0.5～4、0.25～1、0.5～>16、0.25～4、1～2、0.5～1、1～2 mg/L；VRC對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC值范圍分別為0.03～0.5、0.03、0.06～2、0.03～0.125、0.5～>16、0.125～8、0.25～2、0.125～0.5、0.25～2 mg/L；POS對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC值范圍分別為0.03～0.125、0.03～0.125、0.03～0.5、0.125～1、0.125～>16、0.25～0.5、0.25～2、0.125～0.25、0.06～0.25 mg/L；CAS對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC值范圍分別為0.06～0.25、0.125～2、0.125～0.25、0.03～0.125、0.03～1、0.03～0.125、0.06～0.125、0.03 mg/L；MCF對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的MIC值范圍分別為0.03～0.25、1、0.03 mg/L。MCF對(duì)受測的曲霉MEC值均為0.03 mg/L。CAS和MCF對(duì)新生隱球菌MIC值均≥16 mg/L。

由表2可以看出AMB對(duì)受測的熱帶念珠菌、希木龍念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、克柔念珠菌、解脂念珠菌、羅倫隱球菌、毛孢子菌、馬爾尼菲籃狀菌、茄病鐮刀菌、毛霉的MIC值均≤2 mg/L，但對(duì)多育賽多孢、尖端賽多孢的MIC值分別為>16 mg/L、1～8 mg/L；FLC對(duì)受測的茄病鐮刀菌、賽多孢菌、毛霉的MIC值均>64 mg/L；ITR對(duì)茄病鐮刀菌、多育賽多孢、卷枝毛霉等MIC值分別為8 mg/L、>16 mg/L、>16 mg/L；VRC對(duì)受測的茄病鐮刀菌、多育賽多孢及毛霉的MIC值均≥16 mg/L；POS對(duì)茄病鐮刀菌、多育賽多孢、卷枝毛霉等的MIC值均>16 mg/L；MCF和CAS對(duì)毛孢子菌、茄病鐮刀菌、毛霉及尖端賽多孢菌的MIC或MEC值均≥16 mg/L，對(duì)多育賽多孢菌抑菌的MEC值分別為8 mg/L和4 mg/L。

3 討 論

本研究顯示AMB對(duì)受試的幾乎所有侵襲性真菌病的致病菌都有良好的抑菌活性，提示AMB適用于治療侵襲性真菌病。但由于土曲霉對(duì)AMB天然耐藥，AMB并不適用于治療土曲霉感染[9]。同時(shí)AMB對(duì)賽多孢菌的抑菌活性亦較差，提示AMB并不適用于治療賽多孢菌感染。

表2 7種抗真菌藥對(duì)侵襲性真菌病致病菌的MIC/MEC (mg/L)

念珠菌和曲霉 (土曲霉除外)對(duì)AMB具有良好的敏感性，并且耐唑類藥物的念珠菌和曲霉對(duì)AMB仍然具有均有良好的敏感性，提示AMB適用于治療念珠菌和曲霉感染，特別是對(duì)耐唑類藥物的念珠菌和曲霉的感染。FLC、ITR、VRC對(duì)部分念珠菌的MIC值較高，提示臨床用藥時(shí)需考慮耐藥的問題。POS對(duì)念珠菌的MIC值均≤0.5 mg/L，提示POS比較適用于治療念珠菌感染。ITR、VRC和POS對(duì)部分曲霉的MIC值較高，提示臨床用藥時(shí)需考慮耐藥的問題。CAS和MCF對(duì)念珠菌和曲霉的MIC/MEC值均較低，提示棘白菌素藥物適用于治療念珠菌和曲霉感染。

隱球菌和毛孢子菌對(duì)AMB和唑類藥物的敏感性較好，但對(duì)棘白菌素藥物CAS與MCF敏感性很差，與既往的Fera MT、Montoya AM、Tomazin R等[10-12]研究結(jié)果一致。提示AMB與唑類藥物適用于治療隱球菌和毛孢子菌感染。

馬爾尼菲籃狀菌對(duì)AMB、唑類藥物和棘白菌素藥物的敏感性均較好，提示這三類藥物均適用于治療馬爾尼菲籃狀菌感染。而受測的所有絲狀真菌對(duì)FLC的敏感性很差，提示FLC不適用與治療絲狀真菌導(dǎo)致的侵襲性真菌病。

茄病鐮刀菌對(duì)AMB的敏感性較好，但對(duì)唑類藥物、棘白菌素藥物的敏感性較差，與既往Gupta C等[13]研究結(jié)果一致。提示臨床對(duì)于茄病鐮刀菌感染可采用的藥物有限，而AMB是較合適的藥物。本研究還顯示多育賽多孢菌對(duì)AMB、唑類藥物和棘白菌素藥物均不敏感，而尖端賽多孢菌對(duì)這些藥物的敏感性亦相對(duì)較差，與既往Homa M等[14]的研究結(jié)果一致。對(duì)于這種情況，有學(xué)者認(rèn)為多種抗真菌藥物聯(lián)合治療或許是比較適合的治療賽多孢菌感染的方式[15]。

毛霉菌對(duì)FLU、VRC、CAS、MCF的敏感性較差，而對(duì)AMB、ITR、POS的敏感性較好，與既往Drogari-Apiranthitou M、Vitale RG、Chowdhary A等[16-18]的研究結(jié)果一致。并且AMB對(duì)耐ITR和POS的卷枝毛霉仍有良好的抑菌活性，提示AMB是較適合的治療毛霉感染的抗真菌藥物。

本研究使用CLSI標(biāo)準(zhǔn)化藥敏方案檢測國產(chǎn)AMB和其他常用抗真菌藥物對(duì)侵襲性真菌病致病菌的體外抗菌活性，結(jié)果顯示同其他常用抗真菌藥相比AMB對(duì)分離自中國的常見侵襲性真菌病的致病菌有良好的體外抗菌活性，但土曲霉和賽多孢菌除外。