白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌細胞壁抑制作用研究

胡唐玲 施高翔 徐志慶 段強軍 邵菁 汪天明 吳大強 汪長中,3

(1.安徽省六安市第二人民醫(yī)院臨床藥學部，六安 237008;2.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，合肥 230012;3.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，合肥 230012)

抗真菌藥物根據(jù)對真菌作用靶點分為：以細胞壁為靶點的 (如棘白菌素類)，以細胞膜為靶點的 (如唑類)和以DNA為靶點的灰黃霉素等。由于人類細胞無細胞壁，故基于差異毒力的考慮，以細胞壁為靶點的抗真菌藥物的研發(fā)往往具有良好的應(yīng)用前景。在臨床上對外陰陰道念珠菌病有顯著療效的中藥復(fù)方白頭翁湯對白念珠菌的菌絲、生物膜等毒力因子有抑制作用[1]。本課題組發(fā)現(xiàn)白頭翁湯的正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction，BAEB)抗白念珠菌效果顯著[2]，對是否通過菌體細胞壁發(fā)揮抗菌作用尚不明確。

1 材料與方法

1.1 菌株

白念珠菌C.albicansSC5314，由第二軍醫(yī)大學藥學院姜遠英教授惠贈。

1.2 藥物

白頭翁湯按國家中醫(yī)藥管理局統(tǒng)一組織編審的普通高等類教育中醫(yī)類規(guī)劃教材《方劑學》中的藥物 (白頭翁、黃柏、黃連、秦皮)組成，購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)鑒定。白頭翁湯正丁醇提取物的提取方法按照張夢翔等的提取方法，實驗所稱BAEB為其干粉量，實驗中所用BAEB劑量參照張夢翔等所摸索的BAEB劑量[3]；卡泊芬凈 (上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 試劑

剛果紅 (CR, solarbio)；熒光白 (CFW, sigma)；一抗小鼠抗β-1,3-葡聚糖IgG (Biosupplies Australia Pty Ltd)；二抗Cy3標記的山羊抗小鼠,IgG (abbkine)；0.1%的苯胺藍溶液工作液 (溶于pH為9.6的甘氨酸緩沖液，solaibio)；PBS緩沖液 (pH7.0±2.0，Leagene)；二甲基亞砜 (國藥集團)；RPMI-1640培養(yǎng)基 (life technologies公司)；蝸牛酶 (Sigma)。

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱 (上海博迅實業(yè)公司)；倒置熒光顯微鏡 (Olympus IX81，Japan)；流式細胞儀 (BD AccuriC6)；多功能酶標儀 (ABI Spectra Max M2e，美谷分子儀器 (上海)有限公司)；ABI7500熒光定量PCR儀 (美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；透射電子顯微鏡 (EM-1230，JEOL，日本)，切片機 (瑞典，LKB-NOVA型)。

1.5 菌液配制

從4℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細胞計數(shù)板計數(shù)，RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU/mL備用。

1.6 Spot assay檢測白念珠菌細胞活性[4]

從4℃保存的YPD培養(yǎng)平板上挑取單菌落白念珠菌，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37℃搖床中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，血細胞計數(shù)板計數(shù)，RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至2×106CFU/mL備用。將菌液稀釋成2×105CFU/mL，再按10倍稀釋直至2×101CFU/mL，取100 μL不同濃度菌液分別與100 μL終濃度為0、256、512和1 024 μg/mL的BAEB和終濃度為0.125 μg/mL的陽性對照藥卡泊芬凈混合，依次取5 μL分別點種在固體沙氏培養(yǎng)基上。取100 μL不同濃度菌液分別與100 μL RPMI 1640培養(yǎng)液混合，依次取5 μL分別點種在剛果紅 (100 μg/mL)固體沙氏培養(yǎng)基上和熒光白 (100 μg/mL)固體沙氏培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)48 h后取出，觀察CFU生成情況并拍照。

1.7 流式細胞儀檢測白念珠菌細胞壁中β-1,3-葡聚糖[5-6]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于6孔板中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細胞，無菌PBS洗滌細胞三次，用2%BSA的PBS室溫封閉1 h，與一抗4℃孵育過夜，在PBS中嚴格洗滌除去未結(jié)合的一抗，加入二抗30℃孵育1 h，PBS洗滌細胞，將沉淀重新懸浮于1 mL無菌水中，用流式細胞儀BD AccuriC6檢測。

1.8 酶標儀檢測白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于試管中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細胞，無菌PBS洗滌細胞3次，加入0.1%的苯胺藍溶液工作液，于80℃避光反應(yīng)15 min，室溫冷卻30 min，吸入96孔板中，用酶標儀在398 nm激發(fā)波長和508 nm發(fā)射波長下進行熒光測定[7-9]。

由于過去長期存在過量、盲目施肥，導(dǎo)致農(nóng)田土壤板結(jié)、酸化、鹽漬化等問題日益嚴重。當前，農(nóng)業(yè)耕地中有益微生物嚴重缺失，“土壤修復(fù)”成為涉農(nóng)行業(yè)，尤其是化肥行業(yè)關(guān)注、發(fā)力的新領(lǐng)域。生產(chǎn)環(huán)保、高效、功能的肥料成為化肥生產(chǎn)企業(yè)的新責任。

1.9 流式細胞儀檢測白念珠菌細胞壁中幾丁質(zhì)[6]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈于6孔板中混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細胞，無菌PBS洗滌細胞3次，用4%的甲醛固定40 min，然后用10 mg/L的CFW在37℃染色30 min，用PBS洗滌細胞3次，用流式細胞儀BD AccuriC6檢測。

1.10 qRT-PCR檢測細胞壁生物合成相關(guān)基因的表達[10]

總RNA的提取 2 mL菌液 (2×106CFU/mL)與2 mL終濃度分別為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB混合，37℃孵育6 h后，離心收集菌體，用無菌PBS沖洗3次后進行總RNA提取，調(diào)節(jié)RNA濃度，使模板量一致，具體操作方法參照ToyoBo公司MagExtractor-RNA-提取試劑說明書進行。

引物的設(shè)計與合成 基因序列從NCBI獲得，并用Oligo 7.0軟件設(shè)計所需引物，委托上海生工合成引物，各引物情況見表1。

表1 各引物序列表

逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 6 μL RNA預(yù)變性 (65℃ 5 min，4℃ 1 min)，后加入混合液 (4×DNA Master Mix 55 μL和gDNA Remover 1.1 μL)2 μL，5RT-Master MixII 2 μL混合后進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)完成后將cDNA稀釋10倍備用。

實時熒光定量PCR反應(yīng) 采用SYBR熒光法，反應(yīng)體系25 μL:2×SYBR Green RealtimePCR 12.5 μL，PCR Forward Primer (10 mol/L)1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 10 μL在ABI7500熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。內(nèi)參基因為ACT1每個樣品均設(shè)置3個重復(fù)組，實驗重復(fù)3次。

定量分析 實時熒光定量PCR分別測定目的基因及內(nèi)參ACT1的Ct值，實驗結(jié)果取其平均值,基因表達水平用倍數(shù)變化來表示 (2-△△Ct法)。

1.11 透射電鏡觀察白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)[7]

取1 mL (2×106CFU/mL)菌液分別與1 mL終濃度為0、256、512、1 024 μg/mL BAEB和終濃度為0.003 9 μg/mL的卡泊芬凈混合，37℃，培養(yǎng)12 h后，離心收集細胞，取白念珠菌1 mm3大小，置1 mL離心管內(nèi)離心10 min (2 000 r/min)，固定于2.5%戊二醛 (4℃)4～6 h，再固定于1%鋨酸1 h，30%、50%乙醇、70%醋酸鈾乙醇飽和液、80%、95%乙醇、無水乙醇脫水，浸環(huán)氧丙烷30 min，浸環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶1，2 h，環(huán)氧丙烷∶環(huán)氧樹脂1∶2，1 h，浸環(huán)氧樹脂 (Epon812)2 h，入45℃烤箱中12 h，65℃烤箱中48 h，取出包埋好的組織進行超薄切片 (片厚70 nm)，將切片水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中染色30 min。雙蒸水洗3次，各15 min，入枸櫞酸鉛染液染色15 min，雙蒸水洗3次各10 min，用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察。

1.12 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 BAEB對白念珠菌細胞活性的影響

和空白對照組 (control)相比，熒光白 (CFW)組、剛果紅 (CR)組、卡泊芬凈組和BAEB干預(yù)組的白念珠菌菌落數(shù)均隨著菌體濃度遞減而逐漸減少，且隨著BAEB濃度的增加，白念珠菌菌落數(shù)逐漸減少，活性降低 (見圖1)。

2.2 BAEB對白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖的影響

流式細胞儀檢測用一抗和BAEB干預(yù)后的白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖結(jié)合，加入二抗擴大信號所產(chǎn)生的熒光強度。與空白對照組相比，512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強，且有顯著性差異 (見圖2)。

酶標儀檢測苯胺藍和BAEB作用后的白念珠菌細胞壁的β-1,3-葡聚糖結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強度。與空白對照組相比，256、512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強，且512、1 024 μg/mLBAEB組有顯著性差異 (見圖3)。

2.3 BAEB對白念珠菌細胞壁幾丁質(zhì)影響

流式細胞儀檢測CFW和BAEB干預(yù)后的白念珠菌細胞壁的幾丁質(zhì)結(jié)合所產(chǎn)生的熒光強度。與空白對照組相比，256、512、1 024 μg/mL BAEB組熒光逐漸增強，且512、1 024 μg/mL BAEB組有顯著性差異 (見圖4)。

2.4 BAEB對白念珠菌細胞壁合成相關(guān)基因表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，256 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)6.60、1.60、8.48、9.52、9.30倍；512 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)11.34、9.46、28.32、37.07、20.99倍；1 024 μg/mL BAEB組FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8分別下調(diào)5.57、2.96、3.29、4.47、3.00倍 (見圖5)。

2.5 透射電鏡觀察BAEB干預(yù)后白念珠菌細胞壁的變化

空白對照組細胞壁結(jié)構(gòu)比較完整，細胞壁厚度正常。256、512、1 024 μg/mL BAEB組和卡泊芬凈組細胞壁結(jié)構(gòu)都有破損，細胞壁厚度較薄 (見圖6)。

3 討 論

細胞壁是白念珠菌最外層結(jié)構(gòu)，完整的細胞壁呈剛性結(jié)構(gòu)，可以作為物理化學屏障保護細胞，并可以調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。白念珠菌細胞壁主要組分是多糖，包括β-葡聚糖、幾丁質(zhì)、甘露聚糖等，其中最外層大多是甘露聚糖和甘露糖蛋白，β-葡聚糖和幾丁質(zhì)則構(gòu)成細胞壁的骨架[11]。白念珠菌感染時，正是通過其細胞壁的主要組分與宿主細胞上相應(yīng)受體的相互作用介導(dǎo)對靶細胞的損傷。因此，研究針對細胞壁的抗白念珠菌藥物對于防治白念珠菌感染具有重要意義。

熒光白 (CFW)、剛果紅 (CR)、卡泊芬凈均是真菌細胞壁抑制劑。實驗結(jié)果顯示，和空白對照組 (control)相比，含CFW、CR、卡泊芬凈培養(yǎng)基上的白念珠菌菌落明顯減少；在含BAEB的培養(yǎng)基上，隨著BAEB濃度遞增，白念珠菌菌落逐漸減少，表明BAEB對白念珠菌活性也有抑制作用。

圖1BAEB對白念珠菌細胞活性的影響圖2抗β-1,3-葡聚糖抗體與β-1,3-葡聚糖結(jié)合的熒光強度 (**P<0.01)圖3苯胺藍與β-1,3-葡聚糖結(jié)合熒光的強度 (*P<0.05；**P<0.01)圖4CFW與幾丁質(zhì)結(jié)合熒光的強度 (*P<0.05；**P<0.01)圖5qRT-PCR法檢測BAEB對白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖及幾丁質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達的影響 (*P<0.05)

Fig.1Effect of BAEB on activity ofCandidaalbicansFig.2Fluorescence intensity of anti-β-1,3-glucan antibody binding to β-1,3-glucan (**P<0.01)Fig.3Fluorescence intensity of aniline blue combine β-1,3-glucan (*P<0.05; **P<0.01)Fig.4Fluorescence intensity of CFW combine chitin (*P<0.05; **P<0.01)Fig.5The effects of BAEB on β-1,3-glucan and chitin biosynthesis related gene expression inCandidaalbicanscell wall by qRT-PCR (*P<0.05)

流式細胞術(shù)檢測到，用Cy3標記的二抗和一抗 (即抗β-1,3-葡聚糖抗體)結(jié)合后，隨著BAEB濃度的增加，熒光強度逐漸增強。苯胺藍和白念珠菌β-1,3-葡聚糖特異性結(jié)合，顯示熒光[11]，酶標儀檢測顯示，隨著BAEB濃度的增加，熒光強度逐漸增強。CFW和白念珠菌細胞壁的幾丁質(zhì)有很強的親和力，可以顯示熒光[12]，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著BAEB濃度的增加，熒光強度也逐漸增強。上述結(jié)果表明，BAEB干預(yù)后，有可能破壞了白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性 (integrity)，從而增加了β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露。從宿主-病原體相互作用角度來說，宿主固有免疫細胞表面的模式識別受體 (PRR)既可以識別白念珠菌表面的甘露聚糖和甘露糖蛋白，也可以識別白念珠菌細胞壁暴露的內(nèi)層的β-葡聚糖和幾丁質(zhì)，而Dectin-1即為β-1,3-葡聚糖的高親和性受體，可介導(dǎo)識別和吞噬白念珠菌[13-14]。因此，藥物作用所導(dǎo)致的白念珠菌細胞壁β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露在誘導(dǎo)抗真菌免疫應(yīng)答中發(fā)揮了潛在的重要作用。

通過抑制或干擾白念珠菌細胞壁成分的生物合成能有效地抑制或殺滅真菌。FKS1是白念珠菌葡聚糖合酶調(diào)控基因[15-16]，CHS1,2,3,8是白念珠菌幾丁質(zhì)合酶相關(guān)基因[17-20]。qRT-PCR檢測顯示，BAEB干預(yù)后均能使這些基因下調(diào)，且有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)，表明BAEB可能會抑制白念珠菌細胞壁葡聚糖和幾丁質(zhì)的生物合成。

TEM可直接觀察白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性?？瞻讓φ战M白念珠菌的細胞壁厚度正常，結(jié)構(gòu)完整，而256、512、1 024 μg/mL BAEB組細胞壁厚度變薄，并且結(jié)構(gòu)有破損，提示BAEB可以破壞細胞壁而損傷白念珠菌。

本研究顯示，BAEB既能通過影響白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性引起β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的暴露，也能抑制β-1,3-葡聚糖合酶、幾丁質(zhì)合酶生物合成相關(guān)基因的表達，因此表明BAEB能從多個角度靶向細胞壁進而抑制白念珠菌，為白念珠菌病治療提供可靠的依據(jù)。

圖6BAEB對白念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)的影響 (每組左圖為30 000×，右圖為50 000×)：A.空白對照組；B.256 μg/mL BAEB；C.512 μg/mL BAEB；D.1 024 μg/mL BAEB；E.0.00 39 μg/mL卡泊芬凈

Fig.6Candidaalbicanscell wall structure after BAEB intervention (the left picture of each group is magnified by 30 000× and the right picture is magnified by 50 000×): A.control; B.256 μg/mL BAEB; C.512 μg/mL BAEB; D.1 024 μg/mL BAEB; E.0.003 9 μg /mL caspofungin