甘蔗尾中酵母菌的分離與鑒定

郭艷霞，楊承劍，唐慶鳳，彭開屏，唐振華，李孟偉，李麗莉，梁 辛*，謝 芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

甘蔗尾是指甘蔗頂上2～3個嫩節(jié)和其附帶的整個青綠色葉片的統(tǒng)稱，質(zhì)量約為甘蔗質(zhì)量的10%，又稱“甘蔗葉梢”。在收獲甘蔗時，甘蔗尾常被丟棄，造成甘蔗尾嚴重過剩，利用率低，大部分甘蔗尾都被焚燒，造成環(huán)境污染。在19世紀80年代，保國裕[1]就提出利用甘蔗尾作為飼料利用。甘蔗尾新鮮狀態(tài)下中大約含70%的水分，風干狀態(tài)下約含7%的粗蛋白質(zhì)，32%的總糖分，30%的粗纖維和7%的有機酸，還含有一定量的維生素、脂肪和酶類等[2]，營養(yǎng)成分相對豐富，并且適口性好，可作為飼養(yǎng)反芻動物的一種良好青綠飼料。但是，目前甘蔗尾飼料化利用率太低，如果將甘蔗尾葉進行青貯處理利用的話，不僅能提高甘蔗尾的飼料利用率和動物的消化吸收率，而且能降低對環(huán)境的污染，實現(xiàn)物質(zhì)循環(huán)和可持續(xù)發(fā)展。甘蔗尾自然青貯過程有大量乳酸菌參與，但酵母菌的種類和數(shù)量也不容忽視[3]。酵母菌利用青貯飼料中的糖分進行繁殖，可增加青貯飼料中蛋白質(zhì)含量，同時生成乙醇等，使青貯飼料具有酒香味，提高飼料的適口性[4]。目前，酵母菌的分離鑒定多在酒類[5]、面食[6]、飲料[7]、酸奶[8]等領(lǐng)域，酵母菌在飼料行業(yè)也常被用做反芻動物飼料活性添加劑，以改善飼料的營養(yǎng)價值來提高動物生長和生產(chǎn)性能[9]。有大量研究從反芻動物用飼料中分離了酵母菌，劉龍海等[10]從甘肅5個奶牛場的飼草和飼料中共分離鑒定出3株釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）、2株戴爾有孢圓酵母菌（Torulaspora debrueckii）、4株漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）、3株淺黃隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens），并且發(fā)現(xiàn)這3株釀酒酵母對奶牛乳房炎有不同的抑菌作用；郭燕等[11]從蛋白飼料中分離鑒定出了出釀酒酵母和淺黃隱球酵母兩種酵母菌；楊承劍等[12]從自然堆放發(fā)酵的木薯渣中分離出3株乙醇假絲酵母和5株皺褶假絲酵母；而對打包青貯發(fā)酵的甘蔗尾中附著酵母菌的分離鑒定還少見報道。本試驗采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從打包青貯發(fā)酵的甘蔗尾中分離篩選出發(fā)酵能力較強的酵母菌菌株，并通過形態(tài)學、API 20 C AUX生化鑒定試劑盒鑒定及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）核糖體脫氧核糖核酸（ribosomal deoxyribonucleie acid，rDNA）序列分析分子生物學等方法對菌株進行鑒定，以期為甘蔗尾的飼料化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗尾樣品：新鮮甘蔗尾采自廣西武鳴縣甘蔗種植戶，然后進行揉搓打包青貯，每袋約60 kg，分別于0、15 d、30 d、45 d、60 d、90 d采樣分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeastextractpeptonedextrose agar，YEPD）培養(yǎng)基、YEPD液體培養(yǎng)基：青島科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 化學試劑

無水乙醇、丙三醇（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；酵母菌鑒定試劑盒（比色法API 20 C AUX）：梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；GI036T型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司；XMTE-8112型電熱恒溫水浴鍋、ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；Lambda 35紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蔗尾中酵母菌的分離和純化[13]

8.2.1 半筋菜（碗狀木耳）晾曬方法：把采收后的木耳，快速攤放在紗網(wǎng)上，晾曬厚度以4厘米為宜（宜厚不易?。?jīng)常用鐵鈀上下翻動耳片，待耳片全部達到半干時，隨時在紗網(wǎng)上分段收集呈小堆，并用手輕輕均勻揉好整堆木耳后，在把耳片攤放開，必須達到曬干、曬透為止，此方法晾曬的木耳碗狀型可達到95%以上（通過該方法加工的碗狀菜，一般售價45～55元，碗狀菜黑厚，產(chǎn)量高），一般1～2天可使木耳全部曬干，曬干后的木耳即可銷售，或裝入編織袋內(nèi)可放在通風涼爽的地方儲存。此時，遇有雨天時，提前在晾曬拱棚架上覆蓋好塑料膜，避免木耳澆濕。

取混合均勻的甘蔗尾樣品10 g溶解于90 mL無菌生理鹽水中，在渦旋儀上充分混勻，經(jīng)兩層無菌紗布過濾。吸取1 mL菌液，用無菌生理鹽水稀釋成濃度為10-1～10-6六個梯度的樣液，每個梯度3個平行。分別取各稀釋度樣液200μL，用接種環(huán)均勻涂布于YEPD固體培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)48～72 h，觀察并記錄菌落特征并挑取不同形態(tài)的單個菌落，將鏡檢觀察細胞形態(tài)呈橢圓形或圓形且細胞較大者接種于YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將酵母菌重復劃線幾次，直至鏡檢為單一形態(tài)細胞后，取單一菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫增菌培養(yǎng)24 h后，編號，加同體積的體積分數(shù)為40%甘油保存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 酵母菌生化特性鑒定

酵母菌生化鑒定原理：API 20 C AUX試條由20個含有干燥底物發(fā)的微小管組成，能進行19個同化試驗，這些小管內(nèi)都含半固體微量培養(yǎng)基，只有能以該底物作為唯一碳源時才能生長。鑒定結(jié)果參照生化檢索手冊或鑒定軟件，具體操作步驟按照說明書進行。

1.3.3 酵母菌分子生物學鑒定

（1）酵母菌基因組總DNA的提取

酵母菌基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取參照文獻[14]方法：取1.5 mL的混勻菌液，加入到裝有鋯珠的2 mL鋯珠管內(nèi)，12 000×g離心5 min，棄去上清。加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）溶液，12 000×g離心5 min，棄去上清。然后加入800 μL十六烷基三乙基溴化銨（cetyltriethylammonium bromide，CTAB），敲擊2 min間隔2 min后再敲擊—次。在70℃條件下培養(yǎng)20 min，在10 000×g條件下離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入5 μL核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）酶（10 mg/mL），在37℃條件下培養(yǎng)30 min。然后加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液振蕩（15～30 s）呈白色乳液，13 000 r/min條件下離心10 min，取上清加入到新的離心管中。重復上述步驟直至界面清晰為止。加入0.8倍體積的異丙醇輕微搖勻。在室溫條件下放置5～10 min，DNA沉淀，-20℃過夜。13 000 r/min條件下離心10～15 min，小心倒出上清，可以看到灰白色的DNA沉淀。加入500～750 μL的冷乙醇，將白色沉淀輕輕彈起。在13000r/min條件下離心10～15min，倒出上清，風干DNA。加入50～100 μL的TE緩沖液（視沉淀體積而定），在70℃條件下水浴5 min。用超微量分光光度計測定DNA的濃度。

（2）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將提取的酵母菌基因組DNA送往上海生工生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果拼接后輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，運用BLAST程序?qū)y序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫中的公開序列進行比對，選取GenBank中相似性較高的已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再用MEGA 4.0軟件采用鄰接（neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3.4 酵母菌生長性能測定

挑選分離鑒定出的菌株進行生長性能測定，將保存的菌株先活化，然后將活化好的菌株以5%的接種量接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基，120 r/min、28℃條件下培養(yǎng)24 h。取試驗生長菌液200 μL，用無菌水稀釋20倍，搖勻，以未接種的YEPD液體培養(yǎng)基同樣稀釋20倍為空白對照，用分光光度計測定波長660 nm條件下的OD660nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌菌株的形態(tài)觀察

從0～90 d打包青貯的甘蔗尾樣品中共分離得到的381株酵母菌菌株，通過測定各菌株生長菌液的OD660nm值，得到OD660nm值較高，即生長性能較好的7株酵母菌菌株，分別編號為X1、X3、X4、X6、X7、X9、X10，其中菌株X4來自青貯第15天，菌株X7、X10來自青貯第30天，菌株X6來自青貯第45 天，菌株X1、X3、X9來自青貯第60天。將7株酵母菌菌株分別劃線接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后，菌株X1、X7、X9、X10和菌株X3、X4、X6的菌落形態(tài)及美藍簡單染色鏡檢細胞形態(tài)分別見圖1A、圖1B，菌落及細胞形態(tài)特征見表1。

圖1 酵母菌株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of yeasts

由圖1可知，YEPD培養(yǎng)皿上有單個菌落出現(xiàn)，菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，不透明，邊緣整齊，表面扁平或稍微隆起。鏡檢下，細胞呈現(xiàn)卵圓形或橢圓形，形態(tài)較大。綜上所述，菌落形態(tài)和細胞形態(tài)均符合酵母菌的特征。

由表1可知，菌株X1、X7、X9和X10菌落較大扁平，奶油色，細胞呈卵圓形，多邊出芽，有子囊孢子，與《酵母菌的特征與鑒定手冊》[16]中酵母屬的描述特征基本一致，初步鑒定為酵母屬（Saccharomyces sp.）。菌株X3、X4和X6菌落相對較小微凸起，細胞呈橢圓形，兩端出芽，有假菌絲，與《酵母菌的特征與鑒定手冊》中假絲酵母屬的描述特征一致，初步鑒定為假絲酵母屬（Candida sp.）。

表1 酵母菌菌落形態(tài)和細胞形態(tài)特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of yeasts

2.2 酵母菌菌株生理生化鑒定結(jié)果

從0～90 d打包青貯的甘蔗尾樣品中分離得到的X1、X3、X4、X6、X7、X9、X10 7株酵母菌菌株，酵母菌的碳源同化試驗結(jié)果見表2。

表2 酵母菌碳源同化試驗結(jié)果Table 2 Results of carbon source assimilation of yeasts

API20CAUX生化試劑盒操作方便省時，但有局限性，只適用于數(shù)據(jù)庫（說明書末的鑒定表），不能鑒定或排除該范圍之外的微生物。由表2可知，7株酵母菌菌株不在說明書的鑒定表中，所以通過API 20 C AUX生化試劑盒無法鑒定出此7株酵母菌菌株的種類。因此僅靠形態(tài)學觀察和生理生化反應很難準確鑒定出菌株的種屬水平，分子生物學鑒定是必不可少的方法。

2.3 酵母菌分子生物學鑒定

2.3.1 酵母菌ITS rDNA序列相似性分析

將分離的7株酵母菌菌株ITS rDNA擴增產(chǎn)物測序結(jié)果同NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST相似性對比分析。結(jié)果如表3所示。

表3 分離酵母菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他已知菌ITS rDNA序列相似性比較Table 3 Sequences similarity comparison of ITS rDNA between the isolated yeasts and the other known yeasts in GenBank database

由表3可知，菌株X1、X7、X9和X10和Kazachstania humilis的相似性達到99%，菌株X3、X4、X6和扁平云假絲酵母（Candida humilis）的相似性達到99%。若兩個菌株整個ITS區(qū)序列相似性＞99%，則可認為是同一種[17]。所以將菌株X1、X7、X9和X10初步鑒定為Kazachstania humilis，菌株X3、X4和X6初步鑒定為扁平云假絲酵母（Candida humilis）。

2.3.2 酵母菌ITS r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

7株酵母菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖2。

圖2 酵母菌ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeasts based on ITS rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株X3、X4、X6與Candidahumilis（HG532084）位于同一大枝，說明之間有很近的親緣關(guān)系，結(jié)合序列相似性對比分析和菌落形態(tài)特點及生理生化特征，菌株X3、X4和X6被鑒定為Candida humilis。菌株X1、X7、X9、X10與Kazachstania humilis（KX951499）位于同一大枝，菌株X1、X7、X9和X10和Kazachstania humilis的相似性達到99%，再結(jié)合菌株的生理生化特點，將菌株X1、X7、X9和X10鑒定為Kazachstania humilis。

2.4 酵母菌生長性能測定

7株酵母菌菌株的OD660nm值結(jié)果如表4所示。由表4可知，菌株X1生長24 h后OD660nm值可達到12.84，菌株X10生長24 h后OD660nm值最低，也達到了9.90。這7株菌株生長較快，表現(xiàn)很好的發(fā)酵性能。

表4 酵母菌液的OD660 nm值Table 4 OD660 nm value of yeasts liquid

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離技術(shù)從0～90 d打包青貯發(fā)酵的甘蔗尾最終分離篩選得到7株酵母菌菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和ITS rDNA基因序列分析，鑒定出3株扁平云假絲酵母（Candida humilis），4株Kazachstania humilis。通過發(fā)酵性能測試，結(jié)果表明，7個菌株在培養(yǎng)24 h后菌體OD660nm值達到9.90～12.84，生長性能較好。對進一步認識和利用豐富的酵母資源具有重要意義，也為甘蔗尾飼料化利用提供了優(yōu)良酵母菌株。