黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化

唐婧紅，范可帷，張 素，陳 雪，李 祝*，代園鳳，張欽語，楊佩斯，趙妗頤，吉玉玉

（1.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.四川省雙流棠湖中學(xué)，四川 成都 610200；4.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

農(nóng)藥泡騰劑是一種相對較新、發(fā)展較晚的特殊劑型[1]。它是由崩解劑（酸源和堿源）和各組分固體顆粒、粉體混合，經(jīng)造粒或直接壓制而成的藥劑，它在水中能迅速崩解產(chǎn)生大量的CO2[2]。崩解后農(nóng)藥活性成分向周圍擴散，這些活性成分接觸到靶標作物后，能有效地發(fā)揮除草、殺蟲或殺菌等方面的活性作用[3]。目前泡騰片在生產(chǎn)上的制備方法主要有5種，分別為酸堿分開濕法制粒[4]﹑干法制粒[5]﹑酸堿混合非水制粒[6]﹑直接壓片和聚乙二醇包裹法[7]。泡騰片在醫(yī)療和飲用方面以有了廣泛的使用，但在農(nóng)藥運用上時間并不長[8]。

雖然已有報道通過黑曲霉（Aspergillus niger）發(fā)酵液防治煙草青枯病[9]。但利用的是黑曲霉的代謝產(chǎn)物進行抑菌作用，而本研究是利用黑曲霉孢子粉進行抑菌作用，制備一種活菌泡騰片。黑曲霉孢子粉具有易貯藏、保藏費用低、可便于運輸、不易污染、環(huán)境適應(yīng)性強、直接投入發(fā)酵、發(fā)酵再生能力強等優(yōu)勢[10-11]。這種泡騰劑在使用時具有攜帶方便、省時、省力和高效等特點[12]。泡騰劑具有獨特的優(yōu)越性，符合現(xiàn)在農(nóng)藥劑型的發(fā)展趨勢[13]。

因此，本研究采用粉末直接壓片法制備黑曲霉泡騰片，以崩解時限、pH值、發(fā)泡量為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗，對黑曲霉泡騰片的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為將來黑曲霉的發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）：貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物教研室，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（Chinacenter for type culture collection，CCTCC）），保藏號CCTCCNO：M206021。

1.1.2 試劑

檸檬酸（分析純）：江蘇強化功能化學(xué)股份有限公司；碳酸氫鈉（分析純）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、可溶性淀粉（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPD-101-2A電熱鼓風恒溫干燥箱：常州市華普達教學(xué)儀器有限公司；YP-30手動液壓壓片機：鶴壁市創(chuàng)新儀器儀表有限公司；PHS-3C型酸度計：上海大普儀器有限公司；78X-Z型片劑四用測定儀：上海黃海藥檢儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉泡騰片的制備工藝

采用粉末直接混合壓片法制備黑曲霉泡騰片。

技術(shù)要點：

（1）黑曲霉固態(tài)發(fā)酵物在65℃鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎，收集備用。

（2）將PEG乙醇溶液加入碳酸氫鈉后混勻烘干，烘干溫度低于60℃，避免溫度過高碳酸氫鈉受熱分解。

（3）將含有PEG 6000溶液的碳酸氫鈉烘干粉碎后，加入酒石酸、黑曲霉孢子粉和粘合劑，壓片前須將原料和輔料充分混勻，避免壓出的泡騰片顏色不均勻。

1.3.2 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化單因素試驗

（1）泡騰片崩解劑種類及比例的確定

泡騰崩解劑由酸源和堿源組成[14]，常用的酸源有檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等；常用的堿源有碳酸氫鈉、碳酸鈉﹑碳酸鈣等[15]。而酸源和堿源的選擇會影響泡騰片的崩解時間、發(fā)泡量等。通過預(yù)實驗對泡騰劑種類進行初步篩選。結(jié)果表明碳酸鈣產(chǎn)氣效果不好且在水中有沉淀，因此選用碳酸氫鈉作為堿源。

選取黑曲霉孢子粉的添加量為10%，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）乙醇溶液質(zhì)量分數(shù)為10%，添加量為7 g/mL，PEG 6000乙醇溶液質(zhì)量分數(shù)為10%，添加量為3.15 g/mL，可溶性淀粉作為填充劑，碳酸氫鈉作堿源，因為蘋果酸吸濕性較強，所以分別以檸檬酸和酒石酸為酸源，采用粉末直接壓片法制備黑曲霉泡騰片，以外觀、黏沖情況為評價指標，選擇最適酸源。

在選擇最佳酸源的基礎(chǔ)上，選擇泡騰片崩解劑（酒石酸∶碳酸氫鈉）比例為1.00∶1.00、1.00∶1.20、1.00∶1.25、1.00∶1.50，按粉末直接混合壓片法制備黑曲霉泡騰片，測定其崩解時限及發(fā)泡量。

（2）潤滑劑種類及質(zhì)量分數(shù)的確定

分別以PEG 6000乙醇溶液、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮為潤滑劑制備黑曲霉泡騰片，其他條件不變，觀察泡騰片外觀，選擇最適潤滑劑。

在選擇最佳潤滑劑的基礎(chǔ)上，選用最佳潤滑劑質(zhì)量分數(shù)分別為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的PEG 6000乙醇溶液進行試驗，觀察泡騰片黏沖情況。

（3）粘合劑質(zhì)量分數(shù)的確定

預(yù)試驗表明，蔗糖溶液吸濕性較大，所以選用PVP粘合劑。選擇聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液的質(zhì)量分數(shù)為2.5%、5%、7.5%，按上述方法制備泡騰片，觀察壓片時模具的黏沖和泡騰片的外觀。

（4）崩解劑添加量的確定

選擇崩解劑的添加量為60%、65%、70%制備黑曲霉泡騰片，觀察壓片情況并測定其崩解時限。

（5）黑曲霉孢子粉添加量的確定

預(yù)試驗表明，黑曲霉孢子粉的添加量會影響泡騰片的崩解時限，所以，需要選擇合適的孢子粉添加量。選擇黑曲霉孢子粉的添加量為10%、15%、20%、25%、30%，以外觀和崩解時限為評價標準，確定泡騰片中孢子粉添加量的范圍。

1.3.3 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響較大的3個因素崩解劑比例（A）、黑曲霉孢子粉添加量（B）、崩解劑的添加量（C）為考察因素，崩解時間為評價指標，選擇L9（34）正交試驗設(shè)計進行3因素3水平的正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

1.3.4 檢測分析方法

（1）發(fā)泡量的測定[16]

取一只燒杯，加200 mL水，投入泡騰片1 g，立即將所產(chǎn)生的氣體導(dǎo)入一倒立、充滿水的100 mL量筒中，至不再有氣體產(chǎn)生時，記錄量筒中氣體的體積，即為發(fā)泡量。

（2）崩解時限的檢查[17]

取1片泡騰片（3.5 g/片）于含200 mL水的250 mL燒杯中，水的溫度為（25±5）℃。把泡騰片放入水中開始計時，等完全崩解時終止計時，即為崩解時限。同法檢查6片，各片均應(yīng)在5 min內(nèi)崩解。如有1片不能完全崩解，應(yīng)另取6片復(fù)試，均應(yīng)符合2015版《中國藥典》規(guī)定。

（3）pH值測定

取泡騰片3片，分別分散于100mL 20℃蒸餾水中，測定各溶液的pH值，結(jié)果取平均值。

（4）硬度測定[17]

取3片制得的泡騰片，采用片劑四用測定儀檢查泡騰片硬度，將泡騰片放入儀器中，轉(zhuǎn)動100次，取出，減失質(zhì)量≤1%。如減失質(zhì)量＞1%，應(yīng)復(fù)測2次，均應(yīng)符合2015版《中國藥典》規(guī)定。

1.3.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS v18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 泡騰片酸源的確定

以檸檬酸和酒石酸為酸源，制備黑曲霉泡騰片，觀察其外觀和黏沖情況，結(jié)果見表2。

表2 不同酸源制得的泡騰片的評價Table 2 Evaluation of effervescent tablets produced by different acid sources

由表2可知，酒石酸作為崩解劑的酸源時，表面較光滑且黏沖不明顯，而檸檬酸作為崩解劑的酸源時，表面凹凸不平且黏模。因此選擇酒石酸為最優(yōu)酸源。

2.1.2 泡騰片崩解劑配比的確定

以酒石酸為泡騰片的酸源，碳酸氫鈉為泡騰片的堿源，選取不同的崩解劑配比（酸堿比），測定其發(fā)泡量（CO2體積）與崩解時限，結(jié)果見表3。

表3 崩解劑配比對泡騰片發(fā)泡量和崩解時限的影響Table 3 Effect of disintegrating agent ratio on foaming amount and disintegration time-limit of effervescent tablets

由表3可知，隨著酸堿比例的增大，發(fā)泡量先增多后減少，崩解時限先減小后增大。崩解劑的發(fā)泡量多、崩解時限短時，崩解劑較好。因此，崩解劑的最優(yōu)配比為1.00∶1.20。

2.1.3 潤滑劑種類的確定

用硬脂酸鎂作為潤滑劑，崩解劑溶解后有明顯不溶物；用聚乙烯吡咯烷酮出片較順利但崩解劑吸濕性較強；用PEG 6000所得顆粒較均勻，壓片后溶解，未見不溶物。綜合考慮，選擇PEG 6000乙醇溶液作為潤滑劑。

2.1.4 PEG 6000質(zhì)量分數(shù)的確定

潤滑劑PEG6000質(zhì)量分數(shù)對泡騰片的影響結(jié)果見表4。

表4 潤滑劑質(zhì)量分數(shù)對泡騰片的影響Table 4 Effect of lubricant mass fraction on effervescent tablets

由表4可知，當潤滑劑PEG 6000質(zhì)量分數(shù)為10%時，所得泡騰劑的外觀最好，且無黏沖現(xiàn)象，因此潤滑劑最優(yōu)質(zhì)量分數(shù)是10%。

2.1.5 粘合劑質(zhì)量分數(shù)的確定

PVP乙醇溶液質(zhì)量分數(shù)對泡騰片的影響結(jié)果見表5。

表5 粘合劑質(zhì)量分數(shù)對泡騰片的影響Table 5 Effect of binder mass fraction on effervescent tablets

由表5可知，添加質(zhì)量分數(shù)為2.5%的PVP乙醇溶液時，片劑粘合較好、出片順利且吸濕現(xiàn)象不明顯。因此，選擇PVP乙醇溶液的最佳質(zhì)量分數(shù)為2.5%。

2.1.6 崩解劑添加量的確定

選擇不同崩解劑的添加量，測定其崩解時限，結(jié)果見表6。

表6 崩解劑添加量對泡騰片崩解時限的影響Table 6 Effect of disintegrating agent addition on disintegration time-limit of effervescent tablets

由表6可知，隨著崩解劑添加量的增加，崩解時間由56s變成52 s，崩解時限變短，所以選擇崩解劑添加量為65%。

2.1.7 黑曲霉孢子粉添加量的確定

不同的黑曲霉孢子粉添加量對泡騰片外觀及崩解時限的影響結(jié)果見表7。

表7 黑曲霉孢子粉添加量對泡騰片的影響Table 7 Effect of Aspergillus niger spore powder addition on effervescent tablets

由表7可知，隨著黑曲霉孢子粉添加量的增加，崩解時限也隨之增加。因此，選擇孢子粉添加量為10%。

2.2 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化正交試驗

2.2.1 正交試驗結(jié)果與分析

以崩解劑比例（A）、孢子粉添加量（B）、崩解劑添加量（C）為評價因素，崩解時限為評價指標，進行正交試驗，結(jié)果與分析見表8，崩解時限的方差分析結(jié)果見表9。

表8 黑曲霉泡騰片制備工藝優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Design and results of orthogonal experiments for preparation process optimization of Aspergillus niger effervescent tablets

表9 以崩解時限為評價指標的正交試驗結(jié)果與方差分析Table 9 Results and variance analysis of orthogonal experiments using disintegration time-limit as evaluation index

由表9可以看出，以崩解時限為評價指標時，因素對崩解時限影響的主次順序為B＞A＞C，即孢子粉添加量＞崩解劑比例＞崩解劑添加量，孢子粉添加量對崩解時限影響最大（P＜0.05），最優(yōu)組合為A3B3C3，即酒石酸和碳酸氫鈉比例為1.00∶1.25、孢子粉添加量為15%、崩解劑添加量為70%。

2.2.2 驗證試驗

用正交試驗得出的最優(yōu)配比A3B3C3制作泡騰片進行驗證試驗，得出黑曲霉泡騰片的pH為5.7，崩解時限為23 s，發(fā)泡量為40.79 mL/g，硬度（4.3 kg），優(yōu)于其他試驗組。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗得出黑曲霉泡騰片的最優(yōu)制備工藝條件為酒石酸與碳酸氫鈉的比例1.00∶1.25，崩解劑的添加量70%，孢子粉添加量15%，質(zhì)量分數(shù)為10%的聚乙二醇6000乙醇溶液為潤滑劑、添加量為3.15 g/mL，質(zhì)量分數(shù)為2.5%的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液為粘合劑、添加量為7 g/mL。在此最優(yōu)工藝條件下，制備的黑曲霉泡騰片pH為5.7、黏沖現(xiàn)象不明顯，崩解時限（23 s）、發(fā)泡量（40.79mL/g）、硬度（4.3 kg），均符合2015版《中國藥典》[17]的規(guī)定。