甲型H1N1流感病毒RNA定量分析在輕型與肺炎患者中的應(yīng)用

吉茂禮,程 濤

1.陜西省商洛市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(商洛726000)，2. 陜西省咸陽市涇陽縣醫(yī)院檢驗(yàn)科(涇陽713700)

主題詞 流感病毒A型, H1N1亞型 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 診斷 預(yù)測

甲型 H1N1流感是由甲型 H1N1流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，最初在墨西哥發(fā)現(xiàn)。人群對甲型H1N1流感病毒普遍易感。H1N1病毒毒株包含豬流感、禽流感和人流感三種基因片段。這種病毒可以在人群中互相傳染。人感染甲型 H1N1流感后的早期癥狀與普通流感相似,患者會出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發(fā)冷和疲勞等,有些還會出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等[1]。感染甲型H1N1的患者中有相當(dāng)一部分病例病情重，進(jìn)展迅速，可發(fā)展為肺炎、呼吸衰竭、多臟器功能障礙，更為嚴(yán)重者可以導(dǎo)致臨床死亡[2]。因此，甲型流感的早期診斷可為其合理預(yù)防、合理救治、提高生存率、降低病死率奠定基礎(chǔ)。本研究采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測甲型流感患者咽拭子中H1N1流感病毒的基因表達(dá)，進(jìn)而為H1N1亞型的早期診斷和治療提供基因依據(jù)。

對象與方法

1 研究對象 收集2016年2月至2017年2月期間于兩院發(fā)熱門診就診的70例甲型流感H1N1亞型患者及30例普通甲流(普通組)的咽拭子標(biāo)本，其中女19例，男51例，年齡0～75歲。依據(jù)H1N1亞型患者病情狀況分為輕型甲流(輕型組)和肺炎甲流(肺炎組)。其中輕型53例，肺炎17 例。甲流感染患者體溫在38℃以上，伴有頭痛、咳嗽、喉痛、全身酸痛、乏力等上呼吸道感染癥狀。1例肺炎H1N1亞型甲流感染患者由于呼吸衰竭，搶救無效死亡，其余病例經(jīng)治療后痊愈。甲流感染患者經(jīng) PCR 核酸檢測確診, H1N1亞型診斷標(biāo)準(zhǔn)符合衛(wèi)生部甲型H1N1流感診療方案[3-4]。甲型H1N1亞型患者分類標(biāo)準(zhǔn)：胸部 X線檢查有片狀陰影；胸部CT 檢查有片狀陰影。當(dāng)出現(xiàn)以上情況之一時(shí)判斷為肺炎病例，否則判斷為輕型病例[2]。本研究得到本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的同意以及所有參與者的知情同意。

2 研究方法 ①對所有甲型流感患者的病例建立數(shù)據(jù)庫，登記年齡、性別、臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、胸部 X 線片和胸部 CT。以第一次檢查結(jié)果為基線資料。②標(biāo)本采集：采集甲流感染患者咽拭子標(biāo)本，標(biāo)本采集后置于密封的帶螺旋蓋的塑料管內(nèi)，塑料袋密封，24 h內(nèi)冷藏運(yùn)輸至咸陽市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室，采用RT-PCR方法確診。血常規(guī)采用日本西森美康SESMESE-2000 全自動血常規(guī)分析儀檢測。③甲型流感普通型病毒和甲型H1N1病毒亞型檢測：采用Trizol法提取咽拭子中的總RNA，采用RT-PCR技術(shù)研究甲型流感患者普通型病毒和甲型H1N1病毒的表達(dá)。利用GenBank的信息，根據(jù)流感病毒基因數(shù)據(jù)庫，分別選擇甲型HlNl流感病毒HA基因和甲型普通流感病毒M基因的核苷酸保守序列(CY083926和CY037368，片段長度分別為152和128 bp)。采用Primer ExPress 2.0軟件設(shè)計(jì)引物，采用β-actin 作為內(nèi)對照。上游引物(F)和下游引物(R)如下：甲型HlNl亞型流感病毒，F(xiàn)1：5'-TGCTATAAACACCAGccTCCC-3’，R1：5’-GCAATGG CCCCAAATAGG-3’；甲型流感病毒，F(xiàn)2：5’-TTCTAACCGAGGGTCGAAACGT-3’，R2：5’-CCA TCCATGAGAGCCTCAAG-3’；β-actin的引物序列為F3：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，R3： 5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’。按操作說明書進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)體系如下：10 μl 2×Taqman通用的PCR預(yù)混物，1 μl 20×miRNA特異性引物，1.33 μl cDNA，7.67μl水；反應(yīng)條件：95℃變性10 min，95℃、1 5s，60℃、1 min，50個循環(huán)，置于4℃ 結(jié)束反應(yīng)。使用熒光定量 PCR儀ABI7500 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和敏感度測定：分別將甲型HlNl流感和甲型流感外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋成108～101拷貝/μl，依次對上述各定量樣品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定敏感度。⑤臨床樣品檢測：用建立的熒光定量RT-PCR方法對疑似甲型流感患者的咽拭子樣本進(jìn)行檢測，并采用上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的甲型普通型和甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)同步檢測，對陽性樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證。⑥測序驗(yàn)證：提取流感病毒基因組RNA作模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行正反向測序，與美國國立生物信息中心(NCBI)進(jìn)行比對驗(yàn)證。

結(jié) 果

1 基線資料 0～18歲年齡段輕型患者多于肺炎，而46歲以上年齡段肺炎患者較多(P<0.01)，見表1。輕型組和肺炎組性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。肺炎組白細(xì)胞總數(shù)(WBC)與輕型組比較顯著降低，而中性粒細(xì)胞分類計(jì)數(shù)(NEUT)則顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，輕型組與普通組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 輕型和肺炎患者在各年齡段分布對比[例(%)]

注：與輕型組比較,*P<0.01

表2 輕型和肺炎患者性別結(jié)構(gòu)對比[例(%)]

注：與輕型組比較，*P>0.05

表3 各組白細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分類結(jié)果比較

注：與輕型組比較,*P<0.01

2 各組咽拭子甲流病毒檢測結(jié)果比較 肺炎組病毒水平與輕型組以及普通組比較顯著上調(diào)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 各組咽拭子甲型流感H1N1型 和普通型病毒RNA水平比較

注：與輕型組比較，*P<0.01;與肺炎組比較，#P<0.01

3 相關(guān)性分析 在甲型H1N1亞型肺炎組中，H1N1病毒表達(dá)水平與白細(xì)胞總數(shù)具有負(fù)相關(guān)性，而與中性粒細(xì)胞分類具有正相關(guān)性(r=-0.933，0.912，P<0.01)，見圖1、2。

圖1 H1N1RNA水平與WBC相關(guān)性

圖2 H1N1RNA水平與NEUT相關(guān)性

4 ROC曲線分析 以肺炎組和輕型組為因變量分析顯示，咽拭子中甲型H1N1流感患者病毒RNA的AUC為0.840(95%CI：0.674～0.903，P<0.01)。在最佳臨界值處的敏感性和特異性分別為93.2%和77.7%。以上顯示咽拭子中H1N1病毒水平在甲型流感病情診斷中有臨床意義，見圖3。

圖3 H1N1在診斷甲型流感中的ROC曲線

H1N1是一種新型流感病毒,可感染人類、禽類、家畜。主要包括人流感、禽流感和豬流感三種流感病毒的核糖核酸和基因片段，同時(shí)有非洲豬流感和亞洲豬流感病毒的特征[5]。2009 年 6 月 11 日，WHO 宣布甲型H1N1流感大流行警告級別升至第六級[6]。甲型H1N1 流感患者的初始癥狀與一般病毒性呼吸道感染相似,流涕、鼻塞、發(fā)熱、頭痛、軀體疼痛,部分患者病情進(jìn)展迅速,體溫大于39℃,可發(fā)展為重癥肺炎，最終發(fā)展為呼吸衰竭、多臟器功能障礙，甚至可導(dǎo)致死亡[7]。熒光定量 PCR 方法已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、病原體檢測等諸多研究領(lǐng)域[1]。熒光定量RT-PCR技術(shù)在鑒別甲型H1Nl流感、甲型流感中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其檢測靈敏度達(dá)102拷貝/μl,3次重復(fù)性試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，具有很好的靈敏度、重復(fù)性以及很強(qiáng)的特異性[8]。張興權(quán)等[9]應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究阿比朵爾體外對2009甲型流感病毒 (H1N1)復(fù)制的影響。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)藥物濃度為25、12.5、6.25 μmol/L時(shí)，H1N1病毒考貝數(shù)分別為(2.56±0.83)、(2.33±0.43)、(2.08±0.48)，而對照組H1N1病毒考貝數(shù)為(4.66±0.59)。提示阿比朵爾明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的復(fù)制。以上研究顯示RT-PCR技術(shù)定量地分析H1N1的RNA病毒表達(dá)水平的變化。在隨后的報(bào)道中進(jìn)一步印證了RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于H1N1甲型流感診斷中的作用。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的RT-PCR病毒定量檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)Cirp能顯著促進(jìn)H1N1甲型流感病毒的增殖,Cirp+BHK-21細(xì)胞在感染H1N1病毒3、9、15、21 h后細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)分別為對照組的111%、103%、167%和235%，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。我們的研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)定量分析了感染H1N1流感病毒初期以及發(fā)展為肺炎患者的咽拭子中的病毒表達(dá)水平,結(jié)果顯示肺炎組H1N1病毒HA基因與輕型組以及普通組比較均顯著上調(diào)(P<0.01),提示隨著甲型流感病情的不斷進(jìn)展病毒水平進(jìn)一步增加。因此,分析甲型流感H1N1病毒RNA表達(dá)水平可以判斷該疾病的狀況,預(yù)測H1N1患者病情的進(jìn)展并且為其治療提供依據(jù)。

研究認(rèn)為,甲型H1N1流感患者在疾病初期白細(xì)胞總數(shù)以正常為主。但當(dāng)病情嚴(yán)重時(shí)，肺炎白細(xì)胞降低人數(shù)顯著超過輕型組，而中性粒細(xì)胞分類比率明顯高于輕型組。以上提示白細(xì)胞總數(shù)降低和中性粒細(xì)胞百分比升高能反映甲型H1N1流感患者病情狀況[2]。王威等[11]分析甲型H1N1流感病毒合并重癥肺炎患者的血常規(guī)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞多表現(xiàn)為不高或降低，白細(xì)胞分類可見淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞增高，亦有病例表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞增高為主。我們的研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。進(jìn)一步的研究顯示年輕患者癥狀較輕,年齡大(≥46歲)的患者癥狀較重。本文的相關(guān)性分析顯示,甲型H1N1流感患者病毒RNA表達(dá)量與外周血白細(xì)胞總數(shù)具有負(fù)相關(guān)性,而與中性粒細(xì)胞比率具有正相關(guān)性。ROC曲線的分析結(jié)果提示H1N1流感患者病毒RNA水平對于甲型流感病情的診斷有較高的靈敏度、特異度和曲線下面積。因此認(rèn)為，H1N1病毒RNA表達(dá)更有效地反映了甲型H1N1流感的病程進(jìn)展,檢測其水平可用于H1N1的早期診斷及病情預(yù)測。