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    虎杖提取白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)研究*

    2018-11-02 06:35:04胡著云戈陽華周瓊夏曙霞徐慶剛宮再興殷雍
    江西醫(yī)藥 2018年9期
    關(guān)鍵詞:虎杖白藜蘆醇抑制率

    胡著云 ,戈陽華 ,周瓊 ,夏曙霞 ,徐慶剛 ,宮再興 ,殷雍

    (1、江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南昌 330006;2、南昌市第三醫(yī)院,南昌 330009)

    前列腺癌(PCa)的發(fā)病率位居所有男性惡性腫瘤的首位,且其死亡率位居男性惡性腫瘤的第2位,僅次于肺癌[1]。2015中國腫瘤登記年報顯示,2011年中國前列腺癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第9位,城市人群中前列腺癌的發(fā)病率和死亡率,在所有男性惡性腫瘤中排名第6位和第9位[2]。

    白藜蘆醇(3′,5′,4′-三羥基芪)是天然存在的多酚化合物,是中藥虎杖的主要活性成分之一,其可通過激活或抑制信號通路、調(diào)解基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期延遲、細(xì)胞凋亡等方式作用于癌細(xì)胞,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。本研究對虎杖提取白藜蘆醇誘導(dǎo)PC-3系細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究,現(xiàn)報告如下。

    1 材料和方法

    1.1 儀器與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司),YP1002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司),SQP型1/1萬電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司),L-550臺式低速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。Leica DMIRB倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS),CO2培養(yǎng)箱(Sanyo,Japan),F(xiàn)AC Sort流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson),酶標(biāo)儀,RPM I1640培養(yǎng)液(Gibcobrl公司),PCR 提取及擴(kuò)增試劑盒(Takara公司)。B iorad凝膠成像分析系統(tǒng) (江蘇捷達(dá)公司)。F12培養(yǎng)基(HyClone Company),胎牛血清(HyClone Company),胰蛋白酶(Difco),噻唑藍(lán)(Sigma),碘化丙啶(PI),RNA 酶、TUNEL檢測試劑盒 (武漢博士德公司),蛋白酶K(ProteinaseK),二氨基聯(lián)苯(DAB)、多聚賴氨酸、二甲基亞砜DMSO (Sigma公司),白藜蘆醇對照品(11535-200502,供含量測定用,20mg,中國藥品生物制品檢定所)。

    1.2 試驗(yàn)藥物提取 本研究選用中藥虎杖產(chǎn)地為江西樟樹,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定與炮制專家鑒定為廖科植物虎杖。采用醇提-樹脂分離工藝提取藥物中的白藜蘆醇成分,并采用萃取和硅膠柱層析相結(jié)合的方法,最終得到含90%白藜蘆醇的提取物[5]。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自中科院昆明細(xì)胞庫,將其置于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代,直至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

    1.4 四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞抑制率 選取第14-16代PC-3細(xì)胞,配成5×104個/ml細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板,于37℃、5%CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng) 24h后, 分別用25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù) PC-3細(xì)胞 24、48和72h,同時設(shè)置對照組僅加入相應(yīng)培養(yǎng)基。干預(yù)完成后,棄去培養(yǎng)基,加入200ml 5mg/m lMTT相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止。吸棄上清液加入50ml DMSO處理,采用酶標(biāo)儀測定OD 450nm時各孔細(xì)胞吸光值(OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行2次,然后計算抑制率。其中抑制率計算公式為(1-藥物干預(yù)組OD/對照組 OD)×100%。

    1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 備好生長狀態(tài)良好的PC-3系細(xì)胞,其中生長范圍為80%-90%,采用0.05%胰蛋白酶將其消化成單細(xì)胞懸液,隨后培養(yǎng)于6cm皿中,密度為5×105個皿,時間為24h,此后分別加入濃度為 0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,充分稀釋、洗滌后取1×106/m l的細(xì)胞待檢測。將細(xì)胞重新懸浮,使其濃度為(2-5)×105/m l,加入 5μl Annexin V-FITC中。待3min后加入20μg/ml的碘化丙錠溶液 10μl,室溫孵育,避光 10min后加入 300μl緩沖液,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析細(xì)胞凋亡情況。

    1.6 Western blot法檢測Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá) 將 25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 白藜蘆醇干預(yù)的PC-3細(xì)胞和對照組細(xì)胞進(jìn)行裂解,BSA法檢測總蛋白量。蛋白制備樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠100V恒壓電泳分離,然后按照凝膠面積以0.65mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5h將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,加入1∶1000稀釋的一抗,4℃孵育過夜,封閉液漂洗后加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG二抗,室溫孵育1.5h,漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光,X線膠片顯影。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計量資料采用t檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。 P<0.05為差異有顯著性意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞抑制率比較隨著白藜蘆醇濃度的增高,PC-3細(xì)胞抑制率明顯增加,各組間比較差異顯著(P<0.05);同時隨著時間的延長,PC-3細(xì)胞抑制率也明顯增加,差異顯著(P<0.05)。 見表 1。

    表1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞抑制率比較(x±s,%)

    2.2 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞凋亡的影響隨著白藜蘆醇濃度的增加,PC-3細(xì)胞凋亡率明顯升高,具有明顯的劑量依賴關(guān)系,呈劑量—效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。 見圖 1。

    2.3 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的影響 隨著白藜蘆醇濃度的增加,PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白的平均光密度均明顯下降,各組間比較差異顯著(P<0.05)。見表2。

    圖1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

    表2 各濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的影響(x±s)

    3 討論

    腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,其中凋亡抑制蛋白在前列腺癌的發(fā)生中起著極為重要的作用[5]。Bcl-2蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控者,同時也是第一個確認(rèn)能對抗細(xì)胞凋亡的基因,其主要是通過線粒體外膜達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)研究顯示,Bcl-2蛋白不僅與前列腺癌的發(fā)生有關(guān),還與前列腺癌的臨床病理特征有關(guān)。且Bcl-2蛋白的過表達(dá)促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展[6]。Survivin蛋白被證實(shí)是作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子,其可參與細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和抑制細(xì)胞凋亡的雙重功能,其在癌細(xì)胞中過度表達(dá)可能是腫瘤預(yù)后不良的一個因素[4]。且國外研究顯示,前列腺癌中Survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤的分期、分級密切相關(guān),Survivin蛋白過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞加快向S期轉(zhuǎn)換,抵抗G期抑制,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。同時,Survivin的組織分布有明顯的選擇性,其在正常成人組織中不表達(dá),但在前列腺癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[6]。

    基于此理論,針對凋亡抑制蛋白進(jìn)行基因治療可以促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖,同時又不影響正常組織,具有良好的靶向性、特異性和安全性[7]。為此尋找能有效干預(yù)細(xì)胞凋亡抑制蛋白的新型藥物成為前列腺癌研究的關(guān)鍵。白藜蘆醇屬于非黃酮多酚類化合物,是中藥虎杖的主要活性成分之一。藥理學(xué)研究表明,其具有良好的抗腫瘤作用,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、增強(qiáng)化療藥物藥效、減少化療不良反應(yīng)等作用[8]。本研究將不同濃度的虎杖白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,PC-3細(xì)胞的增殖抑制、凋亡發(fā)生顯著改變,說明白藜蘆醇對前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡可能具有調(diào)節(jié)作用。隨著濃度的增加,白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制率逐漸增加,且呈現(xiàn)出時間-劑量依賴性,細(xì)胞的形態(tài)及增值情況差別顯著。此外,隨著白藜蘆醇濃度的增加,PC-3細(xì)胞凋亡率明顯升高,具有明顯的劑量依賴關(guān)系?;⒄劝邹继J醇有有效促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡,而通過Western blot提示,白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細(xì)胞Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá),通過降低Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因而本研究認(rèn)白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細(xì)胞生長,其機(jī)制可能與白藜蘆醇通過抑制Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)而阻斷信號通路有關(guān)。白藜蘆醇抑制前列腺癌的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)行深入探討,并需進(jìn)行前列腺癌動物模型結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討,且白藜蘆醇廣泛存在于中草藥及其他植物中,應(yīng)提取不同植物的白藜蘆醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,以便為將白藜蘆醇作為預(yù)防或治療前列腺癌的有效藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和最為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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