虎杖提取白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)研究＊

胡著云 ，戈陽華 ，周瓊 ，夏曙霞 ，徐慶剛 ，宮再興 ，殷雍

(1、江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006；2、南昌市第三醫(yī)院，南昌 330009)

前列腺癌（PCa）的發(fā)病率位居所有男性惡性腫瘤的首位，且其死亡率位居男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌[1]。2015中國腫瘤登記年報顯示，2011年中國前列腺癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第9位，城市人群中前列腺癌的發(fā)病率和死亡率，在所有男性惡性腫瘤中排名第6位和第9位[2]。

白藜蘆醇（3′，5′，4′-三羥基芪）是天然存在的多酚化合物，是中藥虎杖的主要活性成分之一，其可通過激活或抑制信號通路、調(diào)解基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期延遲、細(xì)胞凋亡等方式作用于癌細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。本研究對虎杖提取白藜蘆醇誘導(dǎo)PC-3系細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，YP1002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，SQP型1/1萬電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，L-550臺式低速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。Leica DMIRB倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS)，CO2培養(yǎng)箱（Sanyo，Japan），F(xiàn)AC Sort流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)，酶標(biāo)儀，RPM I1640培養(yǎng)液(Gibcobrl公司)，PCR 提取及擴(kuò)增試劑盒(Takara公司)。B iorad凝膠成像分析系統(tǒng) (江蘇捷達(dá)公司)。F12培養(yǎng)基（HyClone Company），胎牛血清（HyClone Company），胰蛋白酶(Difco)，噻唑藍(lán)（Sigma），碘化丙啶(PI)，RNA 酶、TUNEL檢測試劑盒 (武漢博士德公司)，蛋白酶K(ProteinaseK)，二氨基聯(lián)苯(DAB)、多聚賴氨酸、二甲基亞砜DMSO （Sigma公司），白藜蘆醇對照品(11535-200502，供含量測定用，20mg，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 試驗(yàn)藥物提取 本研究選用中藥虎杖產(chǎn)地為江西樟樹，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定與炮制專家鑒定為廖科植物虎杖。采用醇提-樹脂分離工藝提取藥物中的白藜蘆醇成分，并采用萃取和硅膠柱層析相結(jié)合的方法，最終得到含90%白藜蘆醇的提取物[5]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自中科院昆明細(xì)胞庫，將其置于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，常規(guī)二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)、傳代，直至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞抑制率 選取第14-16代PC-3細(xì)胞，配成5×104個/ml細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng) 24h后， 分別用25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇干預(yù) PC-3細(xì)胞 24、48和72h，同時設(shè)置對照組僅加入相應(yīng)培養(yǎng)基。干預(yù)完成后，棄去培養(yǎng)基，加入200ml 5mg/m lMTT相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止。吸棄上清液加入50ml DMSO處理，采用酶標(biāo)儀測定OD 450nm時各孔細(xì)胞吸光值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行2次，然后計算抑制率。其中抑制率計算公式為（1-藥物干預(yù)組OD/對照組 OD）×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 備好生長狀態(tài)良好的PC-3系細(xì)胞，其中生長范圍為80%-90%，采用0.05%胰蛋白酶將其消化成單細(xì)胞懸液，隨后培養(yǎng)于6cm皿中，密度為5×105個皿，時間為24h，此后分別加入濃度為 0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，充分稀釋、洗滌后取1×106/m l的細(xì)胞待檢測。將細(xì)胞重新懸浮，使其濃度為(2-5)×105/m l，加入 5μl Annexin V-FITC中。待3min后加入20μg/ml的碘化丙錠溶液 10μl，室溫孵育，避光 10min后加入 300μl緩沖液，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot法檢測Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá) 將 25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 白藜蘆醇干預(yù)的PC-3細(xì)胞和對照組細(xì)胞進(jìn)行裂解，BSA法檢測總蛋白量。蛋白制備樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠100V恒壓電泳分離，然后按照凝膠面積以0.65mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5h將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，加入1∶1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜，封閉液漂洗后加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，室溫孵育1.5h，漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線膠片顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。 P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞抑制率比較隨著白藜蘆醇濃度的增高，PC-3細(xì)胞抑制率明顯增加，各組間比較差異顯著（P＜0.05）；同時隨著時間的延長，PC-3細(xì)胞抑制率也明顯增加，差異顯著（P＜0.05）。 見表 1。

表1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞抑制率比較（x±s，%）

2.2 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞凋亡的影響隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細(xì)胞凋亡率明顯升高，具有明顯的劑量依賴關(guān)系，呈劑量—效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05)。 見圖 1。

2.3 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的影響 隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白的平均光密度均明顯下降，各組間比較差異顯著（P＜0.05）。見表2。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

表2 各濃度白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)的影響（x±s）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，其中凋亡抑制蛋白在前列腺癌的發(fā)生中起著極為重要的作用[5]。Bcl-2蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控者，同時也是第一個確認(rèn)能對抗細(xì)胞凋亡的基因，其主要是通過線粒體外膜達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。相關(guān)研究顯示，Bcl-2蛋白不僅與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，還與前列腺癌的臨床病理特征有關(guān)。且Bcl-2蛋白的過表達(dá)促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展[6]。Survivin蛋白被證實(shí)是作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其可參與細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和抑制細(xì)胞凋亡的雙重功能，其在癌細(xì)胞中過度表達(dá)可能是腫瘤預(yù)后不良的一個因素[4]。且國外研究顯示，前列腺癌中Survivin蛋白的表達(dá)與腫瘤的分期、分級密切相關(guān)，Survivin蛋白過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞加快向S期轉(zhuǎn)換，抵抗G期抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。同時，Survivin的組織分布有明顯的選擇性，其在正常成人組織中不表達(dá)，但在前列腺癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[6]。

基于此理論，針對凋亡抑制蛋白進(jìn)行基因治療可以促進(jìn)前列腺腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，同時又不影響正常組織，具有良好的靶向性、特異性和安全性[7]。為此尋找能有效干預(yù)細(xì)胞凋亡抑制蛋白的新型藥物成為前列腺癌研究的關(guān)鍵。白藜蘆醇屬于非黃酮多酚類化合物，是中藥虎杖的主要活性成分之一。藥理學(xué)研究表明，其具有良好的抗腫瘤作用，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、增強(qiáng)化療藥物藥效、減少化療不良反應(yīng)等作用[8]。本研究將不同濃度的虎杖白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，PC-3細(xì)胞的增殖抑制、凋亡發(fā)生顯著改變，說明白藜蘆醇對前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡可能具有調(diào)節(jié)作用。隨著濃度的增加，白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制率逐漸增加，且呈現(xiàn)出時間-劑量依賴性，細(xì)胞的形態(tài)及增值情況差別顯著。此外，隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細(xì)胞凋亡率明顯升高，具有明顯的劑量依賴關(guān)系?；⒄劝邹继J醇有有效促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡，而通過Western blot提示，白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細(xì)胞Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)，通過降低Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因而本研究認(rèn)白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細(xì)胞生長，其機(jī)制可能與白藜蘆醇通過抑制Bcl-2和Survivin蛋白的表達(dá)而阻斷信號通路有關(guān)。白藜蘆醇抑制前列腺癌的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)行深入探討，并需進(jìn)行前列腺癌動物模型結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討，且白藜蘆醇廣泛存在于中草藥及其他植物中，應(yīng)提取不同植物的白藜蘆醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以便為將白藜蘆醇作為預(yù)防或治療前列腺癌的有效藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和最為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。