核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2信號通路在PM2.5致雌性大鼠生殖損傷中的作用

張豐泉，趙杉，董恩恒*，曹錦程，郭旭東

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 新鄉(xiāng)市大氣污染健康效應(yīng)與干預(yù)重點實驗室，新鄉(xiāng) 453000； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分析測試實驗室，新鄉(xiāng) 453000)

目前空氣污染已被證實是威脅人體健康重要危險因素之一， 2012年全球有約300萬人死于空氣污染相關(guān)疾病[1]。顆粒物是空氣污染物的重要組成部分，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)顆粒物(空氣動力學(xué)直徑≤10 μm)對人體具有更強的危害性[2]。

已有研究證實，PM2.5是心血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病的危險因素。雖然目前還不能明確PM2.5對生殖系統(tǒng)的危害性，但越來越多的研究結(jié)果顯示PM2.5可能是影響生殖系統(tǒng)的重要環(huán)境因素之一。過往流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孕期PM2.5暴露濃度增加10 μg/m3時，胎兒出現(xiàn)早產(chǎn)(OR=1.10；95% CI, 1.03-1.18)、低出生體重(OR)=1.05；95%CI, 1.02-1.07)和小于胎齡兒(OR=1.15；95% CI, 1.10-1.20)的危險性明顯升高[3]。我們前期研究結(jié)果顯示，PM2.5不僅影響雌鼠的內(nèi)分泌水平，而且可使胎鼠的活胎率明顯降低[4]；同時PM2.5可破壞子宮的組織結(jié)構(gòu)，使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞變薄，排列混亂；固有層的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和血管數(shù)量也減少[5]。目前PM2.5對生殖系統(tǒng)損傷的研究還比較有限，且PM2.5生殖毒性作用機制不明確。Nrf-2信號通路是機體內(nèi)重要的防御反應(yīng)性系統(tǒng)，當(dāng)機體受有害因素脅迫時可活化Nrf-2，增加Nrf-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活其下游的功能性蛋白如HO-1，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，對機體具有重要的保護(hù)作用。本研究擬將雌性大鼠暴露PM2.5，研究Nrf-2信號通路在PM2.5致雌性大鼠生殖損傷中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

清潔級8周齡雌性SD大鼠30只，體重180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)于河南省生物精神病學(xué)重點實驗室【SYXK(豫)2014-0005】。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字法將實驗動物分為：生理鹽水對照組(control group, control)、1.5 mg/kg PM2.5低劑量暴露組(Low dose exposure group, low Exp)和37.5 mg/kg PM2.5高劑量暴露組(high dose exposure group, high exp)[6]。

1.1.2 試劑與儀器

TNF-α和IL-1βELLISA試劑盒購于Abcam公司，IL-6 ELLISA試劑盒和TRIzol試劑盒購于Invitrogen公司，Nrf-2和HO-1一抗購于Abcam公司，熒光定量PCR儀(AB 7500，美國)，酶標(biāo)儀(Enspire，美國PerkinElmer)，凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem R，美國ProteinSimple)。

1.2 實驗方法

1.2.1 PM2.5染毒

將本實驗室制備的不同濃度PM2.5懸液(濃度分別為2和50 mg/mL)復(fù)溫后，按照晉樂飛等[7]的實驗方法對雌鼠PM2.5染毒暴露。雌鼠麻醉后，將75 μL/100 (g·bw)顆粒物懸液注入雌鼠舌根部，迫使其將PM2.5懸液經(jīng)過口腔吸入肺內(nèi)。連續(xù)染毒10 d。

1.2.2 子宮組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量測定

冰浴研磨制備子宮組織勻漿液，取上清液測定子宮組織中炎性因子含量。用TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒檢測子宮組織上清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。按照各試劑盒說明制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，酶標(biāo)儀于450 nm檢測標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔吸光值，分別繪制TNF-α、IL-1β和IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.2.3 子宮組織中Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)檢測

按照TRIzol試劑盒說明提取子宮組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR檢測Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平。目的基因序列：Nrf-2 上游引物：5’- CTCTCTGGAGACGGCCATGACT -3’，下游引物：5’- CTGGGCTGGGGACAGTGGTAGT-3’；HO-1上游引物：5’- CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC-3’, 下游引物：5’- AGACGCTTTACGTAGTGCTG-3’；β-actin CGTGCGTGACATTAAAGAG-3’，下游引物：5’-TTGCCGATAGTGATGACCT-3’。 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，40個循環(huán)。用2-△△CT值計算目的基因相對表達(dá)量。

1.2.4 子宮組織中Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá)檢測

研磨并提取子宮組織總蛋白，取蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉1.5 h，Nrf-2一抗(1∶500)、HO-1一抗(1∶300)、β-actin一抗(1∶3000)4℃過夜孵育，洗膜后加入二抗(1∶4000)，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮組織中炎性因子含量

注: A為Nrf-2 mRNA的相對表達(dá)量；B為HO-1 mRNA的相對表達(dá)量。aP<0.05 VS Control；bP<0.05 VS Low Exp。圖1 PM2.5對子宮Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平的影響Note. Relative mRNA expressions of Nrf-2 and HO-1(A and B); aP<0.05 VS control; bP<0.05 VS Low Exp.Figure 1 Effects of particulate matter 2.5 (PM2.5)on mRNA expression of NF-E2 related factor 2 (Nrf-2) and heme oxygenase-1 (HO-1) in the rat uterus

對照組子宮TNF-a的含量為(78.67±17.55) pg/(mg·prot)，低劑量組子宮TNF-a的含量為(112.87±26.76)pg/(mg·prot)，與對照組相比，低劑量組子宮TNF-a含量明顯升高(P=0.024)；高劑量組子宮TNF-a的含量為(269.23±31.36) pg/(mg·prot)，也明顯高于對照組(P=0.000)。另外高劑量組TNF-a含量明顯高于低劑量組(P=0.000)。低劑量組和高劑量組子宮IL-1β含量分別為(96.04±22.29)pg/(mg·prot)和(204.21±24.1)pg/(mg·prot)，均明顯高于對照組，差異有顯著性(P=0.003和0.000)；與低劑量組相比，高劑量組子宮IL-1β含量明顯升高(P=0.000)。與對照組相比，低劑量組(102.71±22.23)pg/(mg·prot)和高劑量組(184.47±26.24)pg/(mg·prot)子宮IL-6含量均明顯升高(P=0.001和0.000)；與低劑量組相比，高劑量組子宮IL-6含量明顯升高(P=0.000)(見表1)。

子宮組織中炎性因子含量與PM2.5濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著PM2.5暴露濃度的升高，TNF-a、IL-1β和IL-6不斷升高(r=0.870、0.847和0.855)。

2.2 子宮組織Nrf-2和HO-1 mRNA表達(dá)水平

Nrf-2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量(與內(nèi)參基因的相對表達(dá)量)見圖1。PM2.5低劑量組和高劑量組子宮組織Nrf-2 mRNA的相對表達(dá)量分別為(1.54±0.16)和(2.69±0.28)，均顯著高于生理鹽水對照組，差異有顯著性(P=0.000和0.000)；與PM2.5低劑量組相比，高劑量組Nrf-2 mRNA表達(dá)量顯著高于低劑量組(P=0.000)。

表1 PM2.5對子宮組織中炎性因子含量的影響Table 1 Effects of particulate matter 2.5 (PM2.5) on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1 beta (IL-1β), and interleukin-6 (IL-6)

注：aP<0.05 VS control；bP<0.05 VS Low Exp。

Note.aP<0.05 VS control;bP<0.05 VS Low Exp.

三組間子宮中HO-1mRNA表達(dá)量的變化與Nrf-2 mRNA的變化情況相一致。與對照組相比，PM2.5低劑量組和高劑量組子宮HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P=0.045和0.000)；與低劑量組相比，高劑量組子宮HO-1 mRNA表達(dá)量顯著高于低劑量組(P=0.008)。

2.3 子宮組織Nrf-2和HO-1 蛋白表達(dá)水平

對照組、低劑量組和高劑量組大鼠子宮Nrf-2蛋白和HO-1蛋白的相對表達(dá)量見圖2。與對照組相比，低劑量組和高劑量組子宮Nrf-2蛋白(P=0.011和0.000)和HO-1蛋白(P=0.000和0.000)的相對表達(dá)量均明顯升高。高劑量組子宮Nfr-2的表達(dá)量雖高于低劑量組，但差異無顯著性(P=0.051)。與低劑量組相比，高劑量組子宮HO-1蛋白相對表達(dá)量明顯高于低劑量組子宮HO-1蛋白表達(dá)量(P=0.037)。

注: A為Nrf-2 蛋白的相對表達(dá)量；B為HO-1 蛋白的相對表達(dá)量。aP<0.05 VS Control；bP<0.05 VS Low Exp。圖2 PM2.5對子宮Nrf-2和HO-1 蛋白表達(dá)水平的影響Note. Relative protein expressions of Nrf-2 and HO-1(A and B); aP<0.05 VS control; bP<0.05 VS Low Exp.Figure 2 Effects of PM2.5 on the protein expressions of Nrf-2 and HO-1 in the rat uterus tissue

3 討論

最新的研究報告指出如不改善空氣質(zhì)量，到2050年時每年因空氣污染造成的死亡人數(shù)將增加到660萬人[8]。目前已有很多關(guān)于妊娠期暴露空氣污染物與妊娠結(jié)局相關(guān)性的流行病學(xué)調(diào)查研究。Kingsley等[8]的調(diào)查發(fā)現(xiàn)孕婦暴露于低濃度的PM2.5(2.5 μg/m3)時，發(fā)生早產(chǎn)的危險性升高1.04倍，且新生兒的體重平均減少15.9 g。加拿大一項關(guān)于81.84萬孕婦的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孕婦PM2.5暴露濃度僅增加2 μg/m3時，發(fā)生早產(chǎn)的可能性增加4%，另外如果孕婦伴有糖尿病、先兆子癇時會使早產(chǎn)的危險性分別增加10.6%和8.3%[9]，由此可見當(dāng)孕婦暴露于PM2.5并伴有其他基礎(chǔ)性疾病時，其出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的危險性明顯增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期及新生兒出生后暴露PM2.5可顯著升高新生兒的死亡率，新生兒死亡危險性增加2.66倍[10]。但Kingsley等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期暴露PM2.5雖可降低新生兒體重，但與早產(chǎn)沒有明顯的相關(guān)性(OR=0.86)。這些研究結(jié)果不一致性的原因可能與PM2.5暴露時長、濃度和顆粒物所含成分以及所采用調(diào)查方法、統(tǒng)計分析方法不同有關(guān)。雖然研究結(jié)果有不一致性，但更多的研究結(jié)果證實PM2.5是影響生殖系統(tǒng)的重要環(huán)境因素之一。

PM2.5對人體損傷作用機制主要包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凝血功能異常。已有研究發(fā)現(xiàn)顆粒物可誘發(fā)呼吸、心血管等系統(tǒng)中炎性因子明顯升高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[11-12]，由此可見炎癥反應(yīng)在顆粒物心肺系統(tǒng)損傷中起重要作用。Michikawa等[13]的研究結(jié)果證實，妊娠早期暴露顆粒物可以影響子宮發(fā)育和胎盤的植入，但未對PM2.5生殖損傷的發(fā)生機制做進(jìn)行進(jìn)一步的研究。氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)，氧化應(yīng)激可觸發(fā)多種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)炎性因子的信號通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。我們前期的研究結(jié)果已證實PM2.5能夠損傷子宮組織結(jié)構(gòu)，并誘發(fā)子宮氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。本次研究中子宮組織炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量檢測結(jié)果顯示，暴露PM2.5后子宮組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明顯高于對照組，PM2.5可誘發(fā)子宮組織中炎性因子的釋放。PM2.5暴露組子宮組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于對照組，由此可見PM2.5能夠誘發(fā)子宮炎癥，且隨著暴露PM2.5濃度的增加，子宮組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量不斷升高(結(jié)果見表1)，PM2.5暴露與炎性因子釋放量呈明顯的正相關(guān),這一結(jié)果與已有PM2.5誘發(fā)心肺循環(huán)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的結(jié)果相一致[14]。由此我們推測PM2.5對生殖系統(tǒng)的損傷與其誘發(fā)的子宮炎癥反應(yīng)有關(guān)。

為研究PM2.5誘發(fā)炎癥的機制，本次實驗中我們檢測了Nrf-2信號通路的相關(guān)因子。Nrf-2通路是機體重要的防御系統(tǒng)。Nrf-2是機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵的防御性轉(zhuǎn)錄因子，具有重要的抗氧化、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)作用[15]。當(dāng)機體受到外界脅迫時，Nrf2磷酸化與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，進(jìn)而激活下游的Ⅱ相酶(如HO-1、GST等)，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。HO-1是重要的Ⅱ相酶之一，在機體內(nèi)發(fā)揮抗炎性反應(yīng)和抗氧化損傷作用[16]。本次實驗結(jié)果顯示，當(dāng)雌鼠暴露PM2.510 d后，暴露組雌鼠子宮組織中Nrf-2和HO-1在mRNA和蛋白水平均明顯高于對照組(結(jié)果見圖1和2)，由此可推斷PM2.5可激活Nrf-2及其下游重要的功能蛋白HO-1，使Nrf-2和HO-1表達(dá)升高，抵抗PM2.5對子宮的損傷作用。但本次實驗中子宮中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量卻因PM2.5暴露而顯著升高；且隨著暴露劑量的增加，子宮炎性因子含量不斷升高，進(jìn)而破壞子宮的組織結(jié)構(gòu)。造成這種結(jié)果的原因可能是，PM2.5雖然激活了Nrf-2信號通路，對PM2.5的損傷起到一定的拮抗和保護(hù)作用，但其保護(hù)作用不足以完全抵消PM2.5誘發(fā)的炎癥損傷作用，而最終造成子宮組織損傷。

綜合本次實驗研究的結(jié)果，我們推測雌鼠暴露PM2.5后，雖然體內(nèi)的Nrf-2信號通路可被激活，Nrf-2和其下游的效應(yīng)因子HO-1蛋白的表達(dá)升高，但其保護(hù)作用不足以完全抵消PM2.5的子宮的炎癥損傷作用，而最終造成子宮組織造成損傷。在后續(xù)的研究中需設(shè)法特異性提高Nrf-2信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量，從而降低或消除PM2.5對生殖系統(tǒng)的損傷作用。