結(jié)核潛伏感染診斷新型候選標(biāo)志物的篩選及臨床驗(yàn)證

， ， ，， ， ，建勇

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性傳染病。MTB感染人體后少數(shù)引起活動性結(jié)核病(約10～40%)，而大多數(shù)處于潛伏狀態(tài)(約60～90%)。結(jié)核潛伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)是指MTB刺激人體后出現(xiàn)的持續(xù)免疫反應(yīng)，但無活動性結(jié)核臨床依據(jù)的一種狀態(tài)。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約20%人口感染結(jié)核桿菌，LTBI者中約5%～10%會發(fā)展為活動性結(jié)核病，是活動性結(jié)核病的重要來源，是結(jié)核病防控的重點(diǎn)之一。要實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織的2035年終止結(jié)核病目標(biāo)，早發(fā)現(xiàn)、早診斷LTBI不容忽視。

目前現(xiàn)有的結(jié)核病篩查試驗(yàn)及診斷LTBI的方法有兩種：1.結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)。TST廣泛用于結(jié)核病的篩查及診斷LTBI，由于受接種卡介苗、非結(jié)核分枝桿菌感染及機(jī)體免疫狀態(tài)等因素影響，敏感性及特異性低。2.γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays，IGRAs)。該方法可排除受接種卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌感染等因素影響，較TST提高了敏感性及特異性[1-5]，然而除由于成本-效益的原因難以廣泛應(yīng)用外，更主要的缺陷是仍不能區(qū)分LTBI及活動性結(jié)核病。結(jié)核病的防控及臨床迫切需要尋找診斷LTBI，并能鑒別LTBI及活動性結(jié)核病的新型候選標(biāo)志物。本研究經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，利用商品化的結(jié)核蛋白芯片，將初篩出的LTBI候選標(biāo)志物自制成蛋白芯片，并進(jìn)行臨床驗(yàn)證，以期獲得特異性及敏感性較高的新型組合標(biāo)志物，并尋找可鑒別LTBI和活動性結(jié)核病的候選標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1對象及標(biāo)本來源 選擇2013年1月至2015年12月就診于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的活動性肺結(jié)核患者(ATB組)116例、LTBI者(LTBI組)69例及健康人群(H組)51例，共236例，并收集相應(yīng)血清各1份。各組年齡15～65歲，性別不受限，入組前均簽署知情同意書。

1.1.1對象納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1.1活動性肺結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn) 1痰涂陽和(或)培陽病人；2 X線檢查：肺部有滲出性病變、干酪性病變、空洞、增殖性病變、血行播散性肺結(jié)核病灶；3從未抗結(jié)核治療或正在規(guī)律抗結(jié)核治療中而病灶仍具有活動性的病人；4伴或不伴有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛及發(fā)熱等臨床表現(xiàn)；5血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT．TB)陽性。6排除標(biāo)準(zhǔn)：肺門淋巴結(jié)結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎及其他肺外結(jié)核與肺部病變。

1.1.1.2LTBI組納入標(biāo)準(zhǔn) 1無結(jié)核病史；2無咳嗽、咳痰、咯血及發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)及全身臨床表現(xiàn)；3體格檢查無陽性發(fā)現(xiàn)；4 PPD陽性(硬結(jié)平均直徑≥10mm 及伴水皰、壞死及淋巴管炎)；5胸部CT、腹部彩超、子宮雙附件(女)、前列腺(男)等檢查無異常；6血T-SPOT.TB陽性。

1.1.1.3健康人群組納入標(biāo)準(zhǔn) 1體檢健康人群；2無結(jié)核病史；3血T-SPOT.TB陰性。

1.2 方法

1.2.1收集血清標(biāo)本 用EDTA抗凝管采集各組研究對象肘靜脈血5 mL，3 000 g/min離心10 min，用吸管吸取上清液，加入高壓滅菌凍存管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2利用商品化的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片初步篩選MTB差異響應(yīng)蛋白 選取小樣本血清標(biāo)本共32份(H組7份、LTBI組9份及ATB組16份)，每組分為a、b、c三個(gè)亞組，每亞組分別與1張MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片雜交(廣州博翀生物科技有限公司)(表1)，同時(shí)檢測IgG(532nm熒光，綠色)和IgM(635nm熒光，紅色)兩類血清抗體，用F Median通道下的信號前景值的中位數(shù)值/B Median通道下的背景值的中位數(shù)值以表示信號強(qiáng)度，F(xiàn)532nm/B532nm及F635nm/B635nm分別表示IgG及IgM抗體信號強(qiáng)度，獲得IgG/IgM 抗體差異響應(yīng)蛋白。

表1 32份血清標(biāo)本與9張芯片雜交分組
Tab.1 Hybridization groups of 32 serum samples reacted with 9 chips

實(shí)驗(yàn)組亞組abc健康人群組(H)133結(jié)核潛伏感染組(LTBI)135活動性肺結(jié)核組(ATB)1510

1.2.3定制MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片 用初篩獲得的IgG/IgM差異響應(yīng)蛋白，根據(jù)信號均值選取響應(yīng)較強(qiáng)的前100個(gè)MTB蛋白，并定制含此100個(gè)MTB特異性蛋白MtbprotTMA芯片。

1.2.4利用定制的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片獲得分辨能力蛋白 將204份血清標(biāo)本(H組44份，LTBI組60份，ATB組100份)與定制蛋白芯片進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)單個(gè)蛋白的P值進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)對分辨ATB組與LTBI組及H組具有一定分辨能力的蛋白。

1.2.5數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理 為消除不同樣本、不同芯片之間的系統(tǒng)性差異帶來的誤差，對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。首先，繪制背景分布圖，去除背景較高的樣本，實(shí)際有效的樣本為199例。基于R語言limma數(shù)據(jù)包下的背景校正算法background Correct，實(shí)現(xiàn)邏輯如下：RG.bgcorrect = backgroundCorrect(RG,method="normexp")，參數(shù)normexp是一種基于局部背景的歸一化方法(PMID: 19068485)。然后，運(yùn)行間歸一化算法normalizeBetweenArrays：RG.bgcorrect = normalizeBetweenArrays(RG.bgcorrect)。歸一化過程中，每個(gè)蛋白對應(yīng)的兩個(gè)點(diǎn)取平均值作為該蛋白響應(yīng)的信號值。

1.3數(shù)據(jù)處理 對獨(dú)立篩選的候選標(biāo)志物，根據(jù)每個(gè)蛋白對每個(gè)樣本的響應(yīng)信號值，假設(shè)該蛋白在所對比的兩組樣本中具有顯著性差異且在兩組樣本中呈更強(qiáng)的響應(yīng)(免疫響應(yīng)較強(qiáng))，并計(jì)算其可信程度，以T test的P值來表征，當(dāng)P值<0.05時(shí)，表示具有顯著差異，認(rèn)為該蛋白具有一定的分辨能力；同時(shí)計(jì)算兩組樣本的信號均值差異比，以fold change(fc，fc=log2)來表示,fc越大，表示響應(yīng)程度越高。對于候選標(biāo)志物的組合，根據(jù)已知分組樣本的響應(yīng)值，基于SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，構(gòu)建判別函數(shù)(Discrimination Function)，并最終繪制ROC曲線，通過曲線下面積(area under curve，AUC)判定準(zhǔn)確性。AUC越接近于1，說明診斷準(zhǔn)確性越高。

2 結(jié) 果

2.1利用商品化的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白

芯片初步篩選MTB差異響應(yīng)蛋白，獲得135個(gè)IgG/IgM 抗體差異響應(yīng)蛋白(表2，圖1)，并定制含有前100個(gè)蛋白的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片(表3)。

表2 135個(gè)IgG/IgM 抗體差異響應(yīng)蛋白
Tab.2 Responsive MTB proteins with significant differences based on the screening results

ATB組>H組ATB組>LTBI組Co-existIgG112210IgM5259Co-exist11Alone116LTB1組>ATB組19

注：IgG-綠色；IgM-紅色Notes: green was for IgG; red was for IgM圖1 IgG/IgM 抗體響應(yīng)蛋白Fig.1 Proteins responding to IgG/IgM antibody

表3 MtbprotTM定制芯片所包含的100個(gè)MTB蛋白相關(guān)信息
Tab.3 Related information of 100 MTB proteins customized into MtbprotTMchip

序 號編 號蛋白名類型與來源序 號編 號蛋白名類型與來源13Rv1821 IgG、IgM5181Rv0538IgG、IgM24Rv3841IgG、IgM5283Rv1293IgM35Rv3154IgG5386Rv3712IgM46Rv0957 IgG5487Rv0652IgM57Rv3009cIgM5588Rv2031cIgG68Rv2291IgM5690Rv0280IgG710Rv0214IgG5791Rv0499IgM811Rv1292IgM5892Rv0894IgG913Rv0583cIgG5993Rv3874IgG1014Rv3480cIgG6094Rv3881cIgG1115Rv0351IgG6195MT3503IgM表3(續(xù))序 號編 號蛋白名類型與來源序 號編 號蛋白名類型與來源1218Rv0440IgG6296Rv1320cIgG1322Rv0576IgG6398Rv2179cIgM1423MT1560.1IgM64101Rv2396IgG1524Rv1876IgG65102Rv2467IgM1625Rv1860IgG66105Rv3418cIgG1726Rv2557IgG、IgM67106Rv3704cIgG1827Rv0423cIgG、IgM68107Rv3810IgG1928Rv2299cIgM69109Rv0944IgM2031Rv1337IgG70110Rv3208IgM2133Rv1498AIgG71111Rv3256cIgM2234Rv1538cIgM72113Rv3301cIgM2335Rv1597IgG73114Rv0270IgM2438Rv2157cIgG74115Rv2114IgM2539Rv2418cIgG75116Rv3472IgM2641Rv2511IgG76117Rv3732IgM2742Rv3190cIgG77118Rv2450cIgM2843Rv3506IgG78119Rv2342IgM2944Rv3653IgG、IgM79121Rv3814cIgM3046Rv3699IgM80122Rv1411cIgG3149Rv3899cIgG、IgM81123Rv1441cIgM3250MT1547IgG、IgM82125Rv2513IgM3352Rv0174IgG、IgM83126Rv0049IgG3453Rv0251cIgG、IgM84127Rv0435cIgM3554Rv0457cIgG、IgM85130Rv0350IgG3655Rv0494IgG、IgM86132Rv0370cIgM3756Rv0684IgG、IgM87133Rv1015cIgM3857Rv0865IgG、IgM88136Rv2368c IgM3958Rv0887cIgG、IgM89139Rv3542cIgM4060Rv3503cIgG、IgM90143Rv2676cIgM

2.2利用定制MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片與較大樣本的臨床標(biāo)本雜交，獲得28個(gè)對分辨ATB組與LTBI組及H組具有一定分辨能力的蛋白(表4)。

表4 對ATB組與LTBI組及H組具有分辨能力的28個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白信息
Tab.4 Information of 28 MTB proteins for differentiating between ATB and LTBI/H groups

NameATB組均值±SDLTBI+H組均值±SDPFold changeRv1441c-IgM9.39±1.018.64±0.701.348×10-51.09Rv2513-IgM7.93±0.867.33±0.633.58×10-51.08Rv2179c-IgG7.69±0.87.19±0.670.00048791.07Rv3301c-IgM6.48±0.735.98±0.770.00067611.08Rv0351-IgM5.86±0.835.37±0.720.00099591.09Rv0494-IgG8.09±0.577.73±0.580.00124261.05Rv2031c-IgG7.56±0.717.16±0.640.0016821.06Rv1498A-IgM7.60±0.657.28±0.590.00540551.04Rv0049-IgM6.87±0.586.61±0.490.00898081.04Rv2031c-IgM5.99±0.805.66±0.620.00960741.06Rv1015c-IgM6.08±0.875.68±0.850.01050131.07Rv0370c-IgM5.50±0.965.08±0.920.01390371.08Rv2368c-IgM6.33±0.566.10±0.530.01682361.04Rv3009c-IgG8.29±1.137.88±0.830.01784081.05Rv1100-IgM5.20±0.584.92±0.770.02285431.06Rv2114-IgM6.15±0.725.85±0.800.02699851.05Rv1821-IgG8.51±0.438.31±0.580.0306851.02Rv0280-IgM5.52±0.545.34±0.400.03135131.03Rv2396-IgM6.29±0.606.07±0.550.03164541.04Rv3190c-IgM6.94±0.416.77±0.480.03165041.03Rv0423c-IgM7.09±0.516.90±0.530.03558091.03Rv3699-IgG10.00±1.399.57±1.050.03842281.04Rv3154-IgG12.11±1.3111.52±1.880.04042211.05Rv0499-IgM6.55±0.836.25±0.860.0405851.05Rv0440-IgM7.31±0.667.07±0.730.04247471.03Rv1860-IgG8.33±0.898.05±0.770.04422721.04Rv0416-IgM6.74±0.636.51±0.690.04423091.03Rv1441c-IgG10.40±0.9310.14±0.640.04676671.03

2.3通過初篩與臨床驗(yàn)證優(yōu)選出可用于診斷LTBI 的8個(gè)新型候選標(biāo)志物，即Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rv1821和Rv0280(表5)。當(dāng)其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，Rv0494 (針對IgG)及Rv1441c(針對IgM)區(qū)別LTB組與ATB組的效能最好，特異性、敏感性及AUC分別為70.5%和84.1%、64.4%和57.6%、69.1%和74.2%。當(dāng)其聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其可區(qū)分H組和LTBI組，診斷LTBI的特異性為90.9%，敏感性為83.1%， AUC為94.1%(圖2)。

表5 診斷LTBI的8個(gè)新型候選物
Tab.5 New candidate biomarkers for diagnosis of LTBI

IDName系數(shù)IDName系數(shù)1Rv0494-IgG0.315Rv0280-IgM0.432Rv3301c-IgM0.356Rv0351-IgM0.483Rv1860-IgG0.417Rv2031c-IgG0.604Rv1821-IgG0.438Rv1441c-IgM0.68

圖2 8個(gè)新型候選物聯(lián)合應(yīng)用診斷LTBI的ROC曲線Fig.2 ROC of eight candidate biomarkers combination diagnosis for LTBI

3 討 論

由于MTB抗原多樣化及復(fù)雜化，蛋白芯片上增加MTB抗原，可提高檢測血清抗體的敏感性及特異性[6-7]。本研究利用商品化的含4262個(gè)MTB蛋白的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片與小樣本臨床血清標(biāo)本進(jìn)行雜交，初篩獲IgG/IgM 抗體差異響應(yīng)蛋白135個(gè)，定制成含響應(yīng)較強(qiáng)的前100個(gè)MTB蛋白的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片，再次與較大樣本臨床血清標(biāo)本進(jìn)行雜交，成功篩選出可作為診斷LTBI的新型候選標(biāo)志物，并獲得國家發(fā)明專利[8]。

研究表明結(jié)核蛋白芯片檢測血清抗結(jié)核抗體廣泛用于輔助診斷肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、肺外結(jié)核以及HIV合并肺結(jié)核等結(jié)核病，其陽性率為45.00%～76.15%，敏感性為61.11%～71.42%，特異性為50.80%～97.50%，聯(lián)合PPD、IGRAs等檢查，其陽性率高達(dá)80.00%～97.20%，敏感性高達(dá)77.55%～89.29%，特異性高達(dá)77.17%～93.75%[9-15]。本研究基于商品化的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片初篩LTBI新型候選標(biāo)志物，進(jìn)而利用自定制的 MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片，篩選出LTBI新型候選標(biāo)志物8個(gè)，包括Rv1860、Rv2031c、Rv1441c、Rv0494、Rv3301c、Rv0351、Rv1821和Rv0280，經(jīng)204份臨床血清標(biāo)本進(jìn)行臨床驗(yàn)證，其組合診斷LTBI的敏感性及特異性分別為83.10%和90.90%，AUC為94.1%，敏感性較單獨(dú)用結(jié)核蛋白芯片檢測高，與結(jié)核蛋白芯片檢測聯(lián)合PPD、IGRAs等檢查基本一致，特異性與上述報(bào)道基本一致，提示8個(gè)新型候選標(biāo)志物的組合用于診斷LTBI具有較高的特異性及敏感性。

結(jié)核病的診斷在缺乏病原學(xué)或病理學(xué)“金指標(biāo)”條件下，免疫學(xué)檢查顯示其重要地位。目前結(jié)核病的篩查及診斷LTBI的方法主要有TST及IGRAs。IGRAs因以早期分泌抗原靶 6(ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)為特異性抗原，其特異性優(yōu)于TST，廣泛用于判斷結(jié)核感染及輔助診斷結(jié)核病，但仍未能區(qū)分結(jié)核是否活動[16-21]。IGRAs的兩種檢測方法對診斷MTB感染具有高度的一致性，總符合率92.7%，然而不能單獨(dú)用于診斷活動性結(jié)核病[22-23],在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)環(huán)境下，IGRAs不適合診斷活動性結(jié)核病[24]。Rv1441c是由PE-PGRS26基因編碼的MTB PE/PPE家族蛋白。國外有學(xué)者通過對200株臨床MTB分離株進(jìn)行 PE-PGRS26基因測序，發(fā)現(xiàn)有50%的菌株存在突變，提示其突變與MTB能夠持續(xù)存活于宿主有關(guān)[25]。Talarico S等報(bào)道Rv0494在MTB的脂肪酸生物合成中充當(dāng)脂肪酸效應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的作用[26]。國內(nèi)有研究表明Rv0494蛋白可能下調(diào)了MTB的生理活性相關(guān)基因的表達(dá)，從而減緩了MTB在壓力環(huán)境下的生長速率[27]。上述研究提示Rv1441c、Rv0494與LTBI有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Rv1441c及Rv0494在LTBI組中分別針對血清抗體IgM及IgG響應(yīng)，而在ATB組及H組中針對血清抗體IgM或IgG無響應(yīng)，Rv0494 (針對IgG)及Rv1441c(針對IgM)區(qū)別LTB組與ATB組的特異性、敏感性及AUC分別為70.5%和84.1%、64.4%及57.6%、69.1%及74.2%，其AUC較接近于8個(gè)候選標(biāo)志物組合的AUC，提示Rv1441c、Rv0494可作為鑒別LTBI和活動性結(jié)核病的候選標(biāo)志物。與IGRAs比較，Rv1441c、Rv0494不僅可診斷LTBI，而且具有一定的區(qū)分LTBI和活動性結(jié)核病的效能。

總之，利用商品化的MtbprotTM結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片初篩LTBI診斷候選標(biāo)志物，并定制結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片，篩選出診斷LTBI新型候選標(biāo)志物組合，對診斷LTBI有較高的敏感性及特異性，其中Rv1441c、Rv0494可作為鑒別LTBI和活動性結(jié)核病的候選標(biāo)志物。本研究為篩選LTBI診斷新型候選標(biāo)志物提供了新方法及思路，但臨床驗(yàn)證標(biāo)本量較少，需要臨床大樣本進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。