• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    EGFR和TREM—1在食管癌中的表達(dá)及黃芪多糖通過抑制炎癥因子輔助食管癌治療的作用研究

    2018-11-01 10:28孫小虎王璐于洪張文陸
    健康大視野 2018年14期
    關(guān)鍵詞:免疫組化食管癌食管

    孫小虎 王璐 于洪 張文陸

    【摘 要】

    目的:探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體1(TREM-1)在食管癌(EC)組織中的表達(dá)及其與臨床病例特征之間的關(guān)系。方法:選取食管癌組織及癌旁組織各72例,采用SP免疫組化染色法檢測(cè)EGFR及TREM-1的表達(dá),分析兩者與EC之間的臨床病理相關(guān)性。另選取食管癌患者術(shù)后給予APS注射液,測(cè)定APS對(duì)血生化指標(biāo)的影響;采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-2,IL-6的含量。結(jié)果:食管癌組織中EGFR和TREM-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織,兩者呈正相關(guān)(P<0.05)。EGFR的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān),TREM-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。黃芪多糖治療可以改善EC手術(shù)患者生化指標(biāo),降低IL-2和IL-6的水平,與P-CT組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:EGFR與TREM-1在EC組織中高表達(dá),且EGFR與TREM-1兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)性??勺鳛槭彻馨╊A(yù)后判斷和基因治療的分子靶標(biāo)。

    【關(guān)鍵詞】 食管癌;表皮生長(zhǎng)因子受體;髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1

    【中圖分類號(hào)】R446.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

    A 【文章編號(hào)】1005-0019(2018)14-003-01

    Expression of EGFR and Trem-1 in Esophageal Carcinoma and the Inhibiting Role of APS in the Treatment of EC by Inflammatory Factors

    SunXiaohu1,2,Wang Lu2, Yu HONG2,Zhang Wenlu1*

    (1.Jinzhou Medical University,Liaoning,Jinzhou 121001;2.Liaoning Cancer Hospital,Liaoning,Shenyang 110042)

    Abstract Objective: The aim of this study is to investigate the expression and clinical significance of EGFR (epidermal growth factor receptor) and TREM-1 (trigger receptor of myeloid cells -1) in esophageal carcinoma (EC). Methods: The study tested 72 cases of EC tissues and 72 cases of para-carcinoma tissue. The expressions of EGFR and TREM-1 were detected by SP immuno-histochemical method.Then analyze the relationships and the correlations between these two antibodies and the clinical pathological factors of esophageal carcinoma. Moreover, APS were given to EC patients, then monitored the numerical value;Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was was used to test the numerical value of IL-2,IL-6.

    Results: Compared with para-carcinoma tissue group, the expression of EGFR and Trem-1 were significantly increased in EC group,there was a positive correlation between the expression of the two (P<0.05). The expression of EGFR was possitively correlated to depth of invasion,lymph node metastasis and clinical stages;the expression of TREM-1 was possitively correlated to depth of lymph node metastasis. Compared with normal control P-CT group, the level of IL-2 and IL-6 in APS group were decreased, and the biochemical criterion were significantly IMPROVed in APS group (P<0.05).

    Conclusions: The expression of TREM-1 and EGFR were significantly increased in EC and P-CT groups, and the expression of EGFR and TREM-1 were possitively related. , and may be employed to indicate the biomarker of prognosis of esophageal carcinoma patients and regarded as a target of gene therapy.

    Key words:esophageal carcinoma; epidemal growth factor receptor;triggering receptor expressed on myeloid cells-1

    食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。我國(guó)EC的患病率近年呈逐年遞增趨勢(shì),發(fā)病人群也逐漸呈年輕化趨勢(shì)[1,2]。手術(shù)治療仍是EC的首選治療手段,而晚期患者只能以延長(zhǎng)生存時(shí)間及改善生存質(zhì)量為主要治療目的[3-5]。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[6]。表皮生長(zhǎng)因子受體在多數(shù)人類腫瘤中也出現(xiàn)高表達(dá)。另外,白介素-2,白介素-6在腫瘤,特別是在EC中也表現(xiàn)出高表達(dá)的現(xiàn)象[7,8]。本研究檢測(cè)EGFR和TREM-1在EC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況,探討EGFR與TREM-1的表達(dá)與食管癌的臨床病理特征的關(guān)系,為EC的診斷、治療及預(yù)后提供客觀的參考指標(biāo);檢測(cè)EC組織中炎癥因子IL-2,IL-6的含量,同時(shí)為EC的傳統(tǒng)中藥綜合療法提供臨床理論指導(dǎo)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 組織標(biāo)本 本研究隨機(jī)選取并整理了2016年3月至2017年6月于遼寧省腫瘤醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為EC的患者共72例作為受試對(duì)象。所有病例經(jīng)核實(shí)患者無重復(fù),臨床病理資料完整。

    1.1.2 試劑及耗材 兔抗人表皮生長(zhǎng)因子(即用型)(GT209307)購(gòu)自基因科技有限公司;兔抗TREM-1抗人單克隆抗體(ab214202)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;IL-2,IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D; SYSTEMS公司;EDTA抗原修復(fù)液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司;注射用黃芪多糖(伯恩)購(gòu)自天津賽諾制藥有限公司。

    1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(jī)(LEICA-RM213)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司;臺(tái)式水浴恒溫振蕩器(TSHZ-A)購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(SIEMENS Advia Centaur XP)購(gòu)自德國(guó)西門子公司;Olympus光學(xué)顯微鏡(H-600)購(gòu)自日本Olympus公司;德國(guó)生物信號(hào)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和標(biāo)本處理 本實(shí)驗(yàn)共分為二組:疾病模型組(EC組):選取EC患者共72例,經(jīng)患者簽署知情同意書后,將受試患者的病理臘塊標(biāo)本及其相關(guān)的臨床病理資料作為疾病模型組。癌旁組織組(P-CT組):選取上述72例食EC患者的癌旁組織(食管癌邊緣外≥2cm),作為癌旁組織組。

    上述受試患者的食管標(biāo)本離體30min內(nèi)進(jìn)行處理。按照分組要求,切取面積約1.0cm×1.0cm的食管組織作為受試組織。取出的食管組織立即采用生理鹽水(Normal saline,NS)進(jìn)行漂洗,放入10%甲醛當(dāng)中進(jìn)行固定,標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋,進(jìn)行SP免疫組化,觀察病理改變。

    1.2.2 SP免疫組化 高壓加熱沸騰 修復(fù)抗原,3%H:O:去離子水以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,分別滴加兔抗人表皮生長(zhǎng)因子(1:200)、兔抗TREM-1抗人單克隆抗體(1-200)(一抗),室溫孵育1h,滴加二抗,室溫孵育 30 min,PBS沖洗2 rain×3次,每張切片滴加DAB 顯色劑100 Ixl,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,PBS 洗滌,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片。

    1.2.3 結(jié)果判定 在雙盲條件下進(jìn)行染色結(jié)果判定,每張組織切片在400倍光學(xué)鏡頭下隨機(jī)選取10個(gè)視野,依照細(xì)胞染色部位,染色密度及染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定。細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色評(píng)分:染色面積評(píng)估:隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)染色面積測(cè)定。0分:無陽(yáng)性細(xì)胞;1分:≤25%;2分:26-50%;3分:51%-100%。染色強(qiáng)度評(píng)分:指多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性:0分:無著色;1分:淡黃色;2 分:棕黃色;3 分:棕褐色。表達(dá)水平通過細(xì)胞染色比例及染色強(qiáng)度得分乘積判定。細(xì)胞膜評(píng)分:0分:無反應(yīng)或少于10%的細(xì)胞膜染色;1分:≥10%的細(xì)胞膜出現(xiàn)微弱染色;2分:≥10%的細(xì)胞側(cè)膜、基底側(cè)膜或完全膜出現(xiàn)中度染色;3分:≥10%細(xì)胞強(qiáng)染色出現(xiàn)在側(cè)膜、基底膜或全部染色; 上述分?jǐn)?shù)之和用來判斷Trem-1和EGFR結(jié)果,>2分者為陽(yáng)性,≤2分者為陰性。

    1.2.4 術(shù)后黃芪多糖治療 在本部分中另外選取經(jīng)手術(shù)治療的食管癌患者20名及健康人10名作為受試對(duì)象,分為三組:空白對(duì)照組(N組):10名健康人作為空白對(duì)照,不給予任何處理因素,只取血樣作為空白對(duì)照組。食管鱗癌術(shù)后模型組(EC組):選取EC切除術(shù)后患者10名,術(shù)后給予常規(guī)處理,簽署知情同意書,入組。黃芪多糖治療組(APS組):選取于我院行食管癌切除術(shù)治療的患者10名,術(shù)后予常規(guī)處理,給予APS注射液綜合治療,一次250mg,一日1次,用藥療程2周。

    上述EC組及APS組受試對(duì)象,于術(shù)前及術(shù)后2周、N組于術(shù)前相同時(shí)間段分別采血,測(cè)定各組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白及特異性腫瘤生長(zhǎng)因子數(shù)值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    上述EC組及APS組受試對(duì)象經(jīng)APS治療2周后,采血,采用ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-2及IL-6的含量。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋配制成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,加樣,配液,洗滌,顯色,終止反應(yīng)。測(cè)定:用酶標(biāo)儀于530nm處,測(cè)定各孔的吸光度值(OD值);通過已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及檢測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值,計(jì)算各組檢測(cè)樣品的濃度。測(cè)定IL-2、IL-6的結(jié)果以nmol/mg 蛋白表示。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);對(duì)計(jì)數(shù)資料行2 檢驗(yàn);多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 EGFR在食管癌及癌旁組織中表達(dá) 免疫組化顯示,EGFR的陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)在食管鱗癌組織中主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi);而在癌旁組織中弱表達(dá)于細(xì)胞膜上。陽(yáng)性表達(dá)率分別為72.2及31.8%,兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    2.2 TREM-1在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TREM-1的陽(yáng)性染色在EC組中主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中,在P-CT組中弱表達(dá)于細(xì)胞膜中,陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.4%及32.7%。兩組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=11.514,P<0.001)(見圖2A、2B)。

    2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 對(duì)本實(shí)驗(yàn)中EGFR和TREM-1在食管鱗癌中的的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析,EGFR的表達(dá)與年齡、性別、組織分化程度無相關(guān)性(P>0.05),與腫瘤的浸潤(rùn)深度(P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、臨床分期(P=0.012)存在相關(guān)性(P<0.05)。TREM-1的表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無相關(guān)性(P>0.05),在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中的陽(yáng)性率分別為77.1%和54.1%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

    2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達(dá)的相關(guān)性 在72例EC患者的食管組織中,TREM-1和EGFR共同陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為46例,共同陰性表達(dá)例數(shù)為16例,經(jīng)X2 檢驗(yàn)列聯(lián)系數(shù)分析,兩者之間的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.520,P<0.001)(見表2)。

    2.4 術(shù)后APS對(duì)各組的治療作用比較

    2.4.1 APS對(duì)血生化等指標(biāo)的影響 檢測(cè)與EC手術(shù)后治療情況密切相關(guān)的相關(guān)血生化等因子,包括TSGF、AST、TP和ALB。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出如下結(jié)果:ASP組及EC組(術(shù)前及術(shù)后2周)的血生化指標(biāo)與N組相比,TSGF、AST值升高,TP和ALB值下降,結(jié)果差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在ASP組中,經(jīng)過ASP治療2周后的各個(gè)血生化指標(biāo)與ASP治療前相比,TP和ALB值升高,TSGF和AST值下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外,術(shù)前對(duì)比術(shù)后2周的ASP組及EC組同組別之間的生化指標(biāo)變化幅度,ASP組中TP和ALB值升高幅度及TSGF和AST值下降的幅度更明顯,存在顯著性差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

    2.4.2 ASP對(duì)術(shù)后炎癥因子IL-2、IL-6的影響檢測(cè)EC術(shù)后應(yīng)用ASP治療后炎性因子IL-2和IL-6的水平變化。ASP組患者的炎癥因子IL-2和IL-6水平與N空白組相近,無顯著性差異(P>0.05)。然而,將單純手術(shù)治療的EC組分別與N空白組和ASP治療組相比,炎性因子IL-2和IL-6均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)。

    3 討論

    食管癌(EC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,近年來,EC除了患病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì),患者也逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。手術(shù)治療仍然是EC所采用的的首選治療手段,目前,傳統(tǒng)中藥逐漸應(yīng)用到腫瘤的治療中,作為綜合治療手段,中藥越來越突顯出其治療的有效性。綜合治療對(duì)早、中、晚期的EC患者均有良好的治療作用[9,10]。

    近年來的研究發(fā)現(xiàn),TREM-1通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)影響了食管癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[11,12];與其相似,EGFR也是一種跨膜的炎性蛋白。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示,在EC的SP染色的組織切片中,TREM-1陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中,EGFR陽(yáng)性表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi);P-CT組中TREM-1和EGFR主要弱表達(dá)于細(xì)胞膜上,說明TREM-1和EGFR在EC中高表達(dá),提示食管癌的發(fā)生、發(fā)展與TREM-1和EGFR密切相關(guān)。TREM-1和EGFR在EC中過度表達(dá),且與腫瘤的TNM分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性。這提示TREM-1和EGFR可能作為早期診斷EC的重要指標(biāo),可以為EC的臨床診斷起到一定的輔助作用。

    通過本次實(shí)驗(yàn)研究,我們還可以看出,EGFR與TREM-1在EC的表達(dá)中存在正相關(guān)性(r=0.520,P<0.05),提示兩者在EC的發(fā)生發(fā)展中存在某種協(xié)同作用。

    在本試驗(yàn)中,通過對(duì)EC手術(shù)切除腫瘤的患者給予傳統(tǒng)中藥黃芪多糖進(jìn)行綜合治療,我們可以得知,與單純手術(shù)治療的EC患者相比,TSGF、AST值顯著下降且TP和ALB值升高。該結(jié)果提示,APS對(duì)EC手術(shù)患者有明顯的治療作用,降低患者術(shù)后的并發(fā)癥,改善患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。我們也可以發(fā)現(xiàn),APS治療能明顯降低炎性因子IL-2及IL-6含量。因此,在EC的治療中,應(yīng)采取手術(shù)治療合并中藥治療的綜合療法。中藥與手術(shù)治療相結(jié)合有諸多好處,手術(shù)前應(yīng)用中藥扶正治療,可減少手術(shù)中的并發(fā)癥。手術(shù)后應(yīng)用的中藥抗腫瘤治療,可以控制癌癥的發(fā)展,以扶正和驅(qū)邪相結(jié)合,對(duì)治療EC有良好的治療效果[13]。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了TREM-1和EGFR在CRC組織中的高表達(dá),對(duì)結(jié)腸癌的的發(fā)生、發(fā)展起調(diào)節(jié)作用,為臨床防治CRC提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí),EC患者術(shù)后輔助以APS治療,能通過降低炎癥因子的表達(dá),改善EC患者的血生化指標(biāo),對(duì)開展食管癌輔助治療具有重要的實(shí)踐意義。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Kashyap MK, Abdel-Rahman O. Expression, regulation and targeting of receptor tyrosine kinases in esophageal squamous cell carcinoma. Mol Cancer. 2018;17(1):54.

    [2] Shi F, Shang L, Yang LY, et al. Neuropilin-1 contributes to esophageal squamous cancer progression via promoting P65-depenent cell proliferation. Oncogene. 2018;37(7):935-943.

    [3] Sakanaka K, Ishida Y, Fujii K,et al. Long-term outcome of definitive radiotherapy for cervical esophageal squamous cell carcinoma. Radiat Oncol. 2018;13(1):7.

    [4] Zhai S, Xue J, Wang Z,et al.. High expression of special AT-rich sequence binding protein-1 predicts esophageal squamous cell carcinoma relapse and poor prognosis. Oncol Lett. 2017;14(6):7455-7460.

    [5] Luo Y, Mao Q, Wang X,et al. Radiotherapy for esophageal carcinoma: dose, response and survival. Cancer Manag Res. 2017;10:13-21.

    [6] Harada E, Serada S, Fujimoto M, et al. Glypican-1 targeted antibody-based therapy induces preclinical antitumor activity against esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017;8(15):24741-24752.

    [7] Anvari K, Sima HR, Seilanian Toussi M, et al. EGFR Expression in Patients withEsophageal Squamous Cell Carcinoma and its Association with Pathologic Response to Preoperative Chemoradiotherapy: A Study in Northeastern Iran. Arch Iran Med. 2017;20(4):240-245.

    [8] Chen CL, Wang Y, Huang CY, et al. IL-17 induces antitumor immunity by promoting beneficial neutrophil recruitment and activation in esophageal squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2017;7(1):e1373234.

    [7] Chen CL, Wang Y, Huang CY, et al. IL-17 induces antitumor immunity by promoting beneficial neutrophil recruitment and activation in esophageal squamous cell carcinoma. Oncoimmunology. 2017;7(1):e1373234.

    [9] Shang QX, Yang YS, Xu LY, et al. Prognostic significance and role in TNM stage of tumor deposits in esophageal cancer. J Thorac Dis. 2017;9(11):4461-4476.

    [10] Zheng WB, Li YJ, Wang Y, et al. Propafenone suppresses esophageal cancer proliferation through inducing mitochondrial dysfunction. Am J Cancer Res. 2017;7(11):2245-2256.

    [11] Wang X, Niu H, Fan Q, et al. Predictive value of EGFR overexpression and gene amplification on icotinib efficacy in patients with advanced esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(17):24744-51.

    [12] Huang J, Fan Q, Lu P, et al. Icotinib in Patients with Pretreated Advanced Esophageal Squamous Cell Carcinoma with EGFR Overexpression or EGFR Gene Amplification: A Single-Arm, Multicenter Phase 2 Study. J Thorac Oncol. 2016;11(6):910-7.

    [13] Huang WH, Liao WR, Sun RX. Astragalus polysaccharide induces the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells by decreasing the expression of Notch1. Int J Mol Med. 2016;38(2):551-7.

    猜你喜歡
    免疫組化食管癌食管
    食管異物不可掉以輕心
    夏枯草水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機(jī)制研究
    嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達(dá)及其臨床意義
    miRNAs在食管癌中的研究進(jìn)展
    MCM7和P53在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點(diǎn)分析
    食管癌術(shù)后遠(yuǎn)期大出血介入治療1例
    胃結(jié)石伴食管嵌頓1例報(bào)道
    中西醫(yī)結(jié)合治療胃食管反流病30例
    一进一出抽搐动态| 亚洲熟女毛片儿| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩免费av在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产精品久久电影中文字幕 | 亚洲美女黄片视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产有黄有色有爽视频| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 两个人看的免费小视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成在线人永久免费视频| 男人操女人黄网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 中文字幕高清在线视频| 亚洲欧美激情在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久国产一区二区| 亚洲av片天天在线观看| 动漫黄色视频在线观看| av在线播放免费不卡| 亚洲av电影在线进入| 91国产中文字幕| 美女扒开内裤让男人捅视频| netflix在线观看网站| 国产99白浆流出| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品 国内视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99热只有精品国产| 免费观看人在逋| 99久久综合精品五月天人人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 另类亚洲欧美激情| 精品免费久久久久久久清纯 | av中文乱码字幕在线| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品自拍成人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产免费男女视频| av天堂在线播放| 美女高潮到喷水免费观看| 久久九九热精品免费| 夫妻午夜视频| www日本在线高清视频| 乱人伦中国视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩成人在线一区二区| 777米奇影视久久| 韩国av一区二区三区四区| 男人舔女人的私密视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 亚洲三区欧美一区| 亚洲片人在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99久久国产精品久久久| 一级毛片女人18水好多| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产在线观看jvid| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 少妇 在线观看| 99re在线观看精品视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 女同久久另类99精品国产91| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产免费现黄频在线看| 欧美乱妇无乱码| 成人影院久久| 少妇 在线观看| 精品人妻在线不人妻| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久视频综合| 韩国av一区二区三区四区| 老熟女久久久| 女人久久www免费人成看片| 麻豆国产av国片精品| 亚洲在线自拍视频| 亚洲三区欧美一区| 亚洲视频免费观看视频| 最近最新免费中文字幕在线| 校园春色视频在线观看| 在线观看舔阴道视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 成人国产一区最新在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 岛国在线观看网站| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美激情高清一区二区三区| 国产97色在线日韩免费| 亚洲午夜理论影院| 乱人伦中国视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99精品久久久久人妻精品| 国产激情欧美一区二区| 悠悠久久av| 天堂√8在线中文| 久9热在线精品视频| 怎么达到女性高潮| 老司机靠b影院| 国产精品二区激情视频| 两性夫妻黄色片| 黄片播放在线免费| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品自拍成人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 9热在线视频观看99| 国产主播在线观看一区二区| 夜夜爽天天搞| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品98久久久久久宅男小说| av视频免费观看在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 99国产精品一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 91av网站免费观看| 一级片'在线观看视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品 国内视频| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩中文字幕欧美一区二区| 丰满的人妻完整版| 久久精品成人免费网站| 成人影院久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美激情极品国产一区二区三区| 三级毛片av免费| netflix在线观看网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜亚洲福利在线播放| 精品欧美一区二区三区在线| 老司机在亚洲福利影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品人妻在线不人妻| 最新的欧美精品一区二区| 制服人妻中文乱码| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 天堂√8在线中文| 很黄的视频免费| av电影中文网址| 亚洲中文字幕日韩| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久亚洲真实| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品免费一区二区三区在线 | 精品久久久精品久久久| 国产不卡一卡二| 亚洲国产欧美一区二区综合| 色尼玛亚洲综合影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天堂动漫精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 韩国av一区二区三区四区| 国产在线观看jvid| 久久精品91无色码中文字幕| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产高清视频在线播放一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 中文字幕制服av| 露出奶头的视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩有码中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品一区二区三卡| 国产黄色免费在线视频| 免费在线观看日本一区| 丝瓜视频免费看黄片| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产男女内射视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 深夜精品福利| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 成人永久免费在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 久久青草综合色| 国产在线一区二区三区精| 久久人妻熟女aⅴ| 免费av中文字幕在线| 12—13女人毛片做爰片一| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲综合色网址| 中文亚洲av片在线观看爽 | 色综合婷婷激情| 亚洲国产精品sss在线观看 | 高清黄色对白视频在线免费看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线观看www视频免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 热99re8久久精品国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| a级片在线免费高清观看视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品国产国语对白av| av在线播放免费不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久狼人影院| 久久精品亚洲av国产电影网| 看免费av毛片| 美女视频免费永久观看网站| 深夜精品福利| 99热网站在线观看| 国产精品免费视频内射| 日韩三级视频一区二区三区| 久久久国产成人精品二区 | av中文乱码字幕在线| 电影成人av| xxxhd国产人妻xxx| 国产野战对白在线观看| 国产黄色免费在线视频| 色综合婷婷激情| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 69精品国产乱码久久久| 香蕉久久夜色| 欧美黑人精品巨大| av福利片在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜福利,免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美精品亚洲一区二区| 岛国毛片在线播放| 大码成人一级视频| 激情视频va一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费看a级黄色片| 午夜福利在线观看吧| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人系列免费观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 韩国av一区二区三区四区| 热99久久久久精品小说推荐| 无人区码免费观看不卡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 麻豆乱淫一区二区| 天天添夜夜摸| 制服人妻中文乱码| 新久久久久国产一级毛片| 母亲3免费完整高清在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 波多野结衣av一区二区av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 动漫黄色视频在线观看| 香蕉丝袜av| √禁漫天堂资源中文www| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲黑人精品在线| 99国产精品99久久久久| 午夜福利一区二区在线看| 欧美乱妇无乱码| 免费日韩欧美在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲中文字幕日韩| 丝袜美腿诱惑在线| 人人澡人人妻人| 色在线成人网| 香蕉国产在线看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 91精品三级在线观看| av片东京热男人的天堂| 精品国产国语对白av| 两个人免费观看高清视频| 丝袜人妻中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品成人在线| av不卡在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 国产激情久久老熟女| 亚洲全国av大片| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲黑人精品在线| 久久99一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 久热这里只有精品99| av片东京热男人的天堂| 超碰97精品在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | videosex国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 下体分泌物呈黄色| 老司机影院毛片| 久久久久久久久免费视频了| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 高清视频免费观看一区二区| 成熟少妇高潮喷水视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产色视频综合| 老司机在亚洲福利影院| 成在线人永久免费视频| 怎么达到女性高潮| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费不卡黄色视频| 悠悠久久av| 又大又爽又粗| 欧美激情久久久久久爽电影 | 男女午夜视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品福利观看| 亚洲九九香蕉| 精品国内亚洲2022精品成人 | 99热国产这里只有精品6| 欧美成人午夜精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜日韩欧美国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 中出人妻视频一区二区| 嫩草影视91久久| 中文欧美无线码| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品国产乱子伦一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 国产麻豆69| 婷婷成人精品国产| 一级片免费观看大全| 一本大道久久a久久精品| 女性生殖器流出的白浆| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产xxxxx性猛交| 精品国产一区二区久久| 999久久久精品免费观看国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 高清欧美精品videossex| 国产三级黄色录像| 久久人妻av系列| 精品人妻在线不人妻| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美久久黑人一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 18在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 亚洲av日韩在线播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产一区二区三区综合在线观看| av天堂久久9| 日韩精品免费视频一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| а√天堂www在线а√下载 | 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久视频综合| av天堂在线播放| 国产成人av教育| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 一区福利在线观看| 在线av久久热| av线在线观看网站| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲三区欧美一区| 免费看十八禁软件| 精品福利观看| cao死你这个sao货| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 99国产极品粉嫩在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品久久久久久精品古装| 视频在线观看一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 一区二区三区激情视频| 免费看十八禁软件| 一二三四在线观看免费中文在| 久久亚洲真实| 欧美不卡视频在线免费观看 | 在线看a的网站| 一本综合久久免费| 91成年电影在线观看| 窝窝影院91人妻| 国产午夜精品久久久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线免费观看的www视频| 黑人猛操日本美女一级片| av欧美777| 高清av免费在线| 久久狼人影院| 亚洲综合色网址| 精品一区二区三卡| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美性长视频在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲七黄色美女视频| 欧美性长视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 两个人看的免费小视频| 宅男免费午夜| 最新美女视频免费是黄的| 久久精品国产清高在天天线| 最新在线观看一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 精品无人区乱码1区二区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看日韩欧美| ponron亚洲| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 成年人黄色毛片网站| 国产成人欧美| 欧美乱妇无乱码| 999精品在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 999精品在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 精品国产亚洲在线| 久久性视频一级片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 嫁个100分男人电影在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人黄色视频免费在线看| 飞空精品影院首页| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 婷婷成人精品国产| 在线观看日韩欧美| 久久久精品区二区三区| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品亚洲av国产电影网| 麻豆成人av在线观看| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久久久精品古装| 久久久国产成人免费| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 精品国产乱码久久久久久男人| 无限看片的www在线观看| 男女免费视频国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩人妻精品一区2区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中亚洲国语对白在线视频| av免费在线观看网站| 高清黄色对白视频在线免费看| 下体分泌物呈黄色| 视频在线观看一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 成人黄色视频免费在线看| 午夜精品国产一区二区电影| 很黄的视频免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久久国产一区二区| 国产av一区二区精品久久| 久久人妻av系列| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品.久久久| 亚洲av成人一区二区三| 中文字幕人妻丝袜制服| 一边摸一边抽搐一进一出视频| av网站免费在线观看视频| 女性被躁到高潮视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜精品在线福利| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产成人免费观看mmmm| 欧美精品高潮呻吟av久久| 高清av免费在线| 亚洲精品一二三| 脱女人内裤的视频| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 91av网站免费观看| 99国产精品一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 我的亚洲天堂| 另类亚洲欧美激情| 久久人妻av系列| 久久香蕉国产精品| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 一区二区三区激情视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜免费成人在线视频| 成人三级做爰电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 高潮久久久久久久久久久不卡| 露出奶头的视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费看十八禁软件| 少妇粗大呻吟视频| 国产成人免费观看mmmm| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 黄色女人牲交| 精品第一国产精品| 国产欧美亚洲国产| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产乱人伦免费视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲 国产 在线| 首页视频小说图片口味搜索| 国产野战对白在线观看| 夫妻午夜视频| 午夜福利,免费看| 美女福利国产在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美日韩精品网址| 亚洲熟女精品中文字幕| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 高清视频免费观看一区二区| 色播在线永久视频| 人成视频在线观看免费观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费在线观看黄色视频的| 在线视频色国产色| √禁漫天堂资源中文www| 十八禁网站免费在线| 在线观看舔阴道视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲三区欧美一区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 搡老岳熟女国产| 搡老乐熟女国产| 国产午夜精品久久久久久| av不卡在线播放| 黄片大片在线免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 性色av乱码一区二区三区2| 水蜜桃什么品种好| av福利片在线| 国产精品久久久av美女十八| 最新美女视频免费是黄的| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品国产高清国产av | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中文字幕色久视频| 在线免费观看的www视频| 精品国产国语对白av| 亚洲五月天丁香| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成+人综合+亚洲专区| a在线观看视频网站| 亚洲伊人色综图| 免费av中文字幕在线| 国产一区二区激情短视频| 国产精品久久久久成人av| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 大码成人一级视频| 国产精品二区激情视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品偷伦视频观看了| 国产日韩欧美亚洲二区| av天堂久久9| 天天添夜夜摸| 在线观看免费视频日本深夜| 国产国语露脸激情在线看| 精品一区二区三卡| 看免费av毛片| 久久99一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成人国语在线视频|