骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病免疫指標(biāo)的影響及臨床療效

周小琳 李棟方 李平甘 羅向陽(yáng)

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)分泌專科（廣州 510120）

目前許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病仍無(wú)有效治療方法，如脊髓炎、格林巴利綜合征、多發(fā)性硬化等，預(yù)后較差，致殘率高，家庭、社會(huì)負(fù)擔(dān)很重。近年來(lái)隨著干細(xì)胞研究越來(lái)越深入，干細(xì)胞的多種治療功能被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，干細(xì)胞治療成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mar?row mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中的一種干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)神經(jīng)的作用［1］。MSCs具有自我增殖和多向分化能力，易于體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，具有較低的免疫原性，國(guó)內(nèi)外已有不少應(yīng)用骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)損傷的研究。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在免疫功能紊亂，抑制神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)可能對(duì)疾病恢復(fù)有幫助［12］。本文就MSCs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病免疫功能的影響及臨床療效做初步探索。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 病例選自2014年11月至2017年11月我科住院部收治的患兒，共30例，其中脊髓炎10例，腦炎12例，格林巴利綜合征4例，多發(fā)性硬化4例，年齡1～15歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒均有相應(yīng)的臨床癥狀，并符合神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)、腦脊液等檢查的表征；（2）脊髓炎、腦炎、格林巴利綜合征、多發(fā)性硬化均符合第8版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）入選前均經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患兒家屬均簽署了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥，如心、肝、腎功能不全，或者嚴(yán)重過(guò)敏體質(zhì)可能對(duì)MSCs過(guò)敏者。正常對(duì)照組為本院體檢健康兒童30例，近期均無(wú)感染史、無(wú)自身免疫性疾病史和其他疾病史，其中年齡和性別構(gòu)成比例與病例組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 MSCs治療方法 所有病例組患兒均在傳統(tǒng)治療的基礎(chǔ)上，加用MSCs進(jìn)行治療。MSCs 10× 106/次，靜脈注射，1次/周，共4次。所有MSCs均由本院生物治療中心采集、培養(yǎng)、凍存，所有標(biāo)本在注射前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格細(xì)胞學(xué)鑒定，除外感染、惡性病變等情況，符合使用標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 免疫指標(biāo)檢測(cè) 在治療前和治療結(jié)束后空腹抽靜脈血2 mL，在6 h內(nèi)取抗凝全血40 μg，去除紅細(xì)胞，加入 CD19+、CD20+、CD4+、CD8+單克隆抗體，室溫下孵育20 min后上機(jī)檢測(cè)。淋巴細(xì)胞亞群采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)。最后由CD4+、CD8+檢測(cè)值計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1.2.3 臨床觀察指標(biāo) 對(duì)比治療前后病例組患兒臨床癥狀、神經(jīng)功能、頭顱MRI有無(wú)改善。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效及頭顱MRI改變情況 病例組30例患兒MSCs治療結(jié)束后，24例臨床癥狀改善，6例臨床癥狀無(wú)明顯改善。病例組30例患兒均存在頭顱或脊髓MRI異常，治療后25例病灶有改善。

2.2 病例組與正常對(duì)照組外周血免疫指標(biāo)表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組相比，治療前病例組患兒外周血CD19+、CD20+比例明顯升高（均P＜0.05）；CD4+、CD4+/CD8+比例降低，CD8+T細(xì)胞百分比升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 病例組與正常對(duì)照組外周血免疫指標(biāo)表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

表1 病例組與正常對(duì)照組外周血免疫指標(biāo)表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

組別病例組正常對(duì)照組t值P值例數(shù)30 30 CD19+34.66±10.80 16.15±3.51 8.92 0.00 CD20+33.90±11.38 15.95±3.43 8.09 0.00 CD4+23.51±6.59 33.21±5.80 6.05 0.00 CD8+26.61±6.40 22.27±5.98 2.71 0.01 CD4+/CD8+1.08±0.45 1.60±0.48 4.27 0.00

2.3 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達(dá)水平比較 病例組患兒經(jīng)MSCs治療后，24例癥狀明顯改善，6例癥狀無(wú)明顯改善。癥狀改善組外周血CD19+、CD20+比例較治療前明顯降低（P＜0.05）；癥狀無(wú)改善組該指標(biāo)與治療前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non?improved group ±s，%

表2 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non?improved group ±s，%

注：a與b比較，c與d比較，P＜0.05；其余指標(biāo)治療前后比較，均P＞0.05

CD19+CD20+組別癥狀改善組癥狀無(wú)改善組例數(shù)24 6治療前34.47±10.19a 36.82±15.10治療后17.80±5.15b 35.6±15.57治療前33.66±10.80c 35.68±15.83治療后17.20±4.96d 35.00±14.11

2.4 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達(dá)水平比較 癥狀改善組的24例患兒外周血CD4+、CD4+/CD8+比例較治療前明顯升高，CD8+比例較治療前明顯降低（P＜0.05）；癥狀無(wú)改善組患兒外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例與治療前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non?improved group ±s，%

表3 癥狀改善組與癥狀無(wú)改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non?improved group ±s，%

注：a與b相比，c與d相比，d與f相比，均P＜0.05；其余指標(biāo)治療前后比較，均P＞0.05

組別癥狀改善組癥狀無(wú)改善組例數(shù)24 6 CD4+治療前23.33±6.95a 24.23±5.38治療后31.85±6.15b 23.25±5.06 CD8+治療前26.56±5.97c 26.80±3.74治療后21.34±5.41d 26.15±4.72 CD4+/CD8+治療前1.08±0.49e 1.10±0.27治療后1.63±0.66f 1.00±0.23

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的免疫改變錯(cuò)綜復(fù)雜，在大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)與大腦發(fā)育息息相關(guān)。T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞從胚胎期開(kāi)始就存在于大腦中，有報(bào)道中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的B細(xì)胞介導(dǎo)中風(fēng)后的認(rèn)知障礙，并可以通過(guò)分泌致病性抗體來(lái)防止脊髓損傷后的功能恢復(fù)［2］。B細(xì)胞在成人脫髓鞘疾病中也發(fā)揮有害作用，可以分泌針對(duì)髓鞘的自身抗體誘導(dǎo)脫髓鞘的發(fā)生［3］。T細(xì)胞具有介導(dǎo)大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)元可塑性的能力，有報(bào)道顯示在炎癥致敏的缺氧缺血性新生兒腦損傷中，CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)受損的大腦并刺激小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)［4］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)格林巴利綜合征、多發(fā)性硬化患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞比例異常，治療后患者癥狀好轉(zhuǎn)，B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞比例趨于正常［5］。本研究也發(fā)現(xiàn)腦炎、脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病外周血CD19+B細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞比例與健康對(duì)照組相比明顯升高，提示B淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，體內(nèi)免疫功能亢進(jìn)；同時(shí)結(jié)果顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時(shí)，CD4+T細(xì)胞及CD4+/CD8+比例降低，CD8+T細(xì)胞百分比升高，說(shuō)明中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染存在T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，這與既往學(xué)者研究結(jié)果相一致。結(jié)合本研究結(jié)果及國(guó)內(nèi)外研究，B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞功能紊亂可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用。

很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病經(jīng)常引起不同程度的功能障礙，臨床上傳統(tǒng)治療很難治愈而且治療的效果有限，近年來(lái)干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為了熱點(diǎn)。既往國(guó)內(nèi)外很多研究證明，MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效，MSCs可以促進(jìn)損傷腦組織恢復(fù)，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并遷移至病灶處發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6-7］。在一項(xiàng)觀察自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs治療后患者神經(jīng)系統(tǒng)明顯提高，隨時(shí)間推移臨床癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，不良反應(yīng)較少［8］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MSCs治療多發(fā)性硬化患者臨床有效率高，并且用多發(fā)性硬化患者自體骨髓MSCs培養(yǎng)擴(kuò)增后再回輸，可以達(dá)到同樣的臨床效果［9］。本實(shí)驗(yàn)小組前期研究發(fā)現(xiàn)MSCs能抑制EAE大鼠動(dòng)物模型炎癥反應(yīng)，在臨床上應(yīng)用MSCs治療多名多發(fā)性硬化患兒，在改善患兒運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)障礙、延長(zhǎng)疾病緩解期，減少?gòu)?fù)發(fā)等方面均取得了明顯的效果，說(shuō)明MSCs發(fā)揮了良好的神經(jīng)免疫保護(hù)作用。本研究結(jié)果也顯示MSCs治療后癥狀改善組患兒外周血B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞指標(biāo)均明顯改善，而癥狀無(wú)明顯改善組患兒外周血免疫指標(biāo)與治療前相比較無(wú)明顯改變，MSCs治療脊髓炎、腦炎、多發(fā)性硬化等神經(jīng)炎癥性疾病取得良好的臨床療效。

MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病療效確切，但其具體的治療機(jī)制尚未完全清楚，有以下幾種可能：（1）MSCs可以分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，能夠經(jīng)血管內(nèi)給藥后遷移到損傷部位，并且可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用［10］；（2）MSCs可分泌出一系列強(qiáng)有力的旁分泌作用因子，通過(guò)提供營(yíng)養(yǎng)支持、抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)［11-12］，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)MSCs在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用［13］；（3）如本結(jié)果研究所示，MSCs通過(guò)抑制外周血T、B淋巴細(xì)胞免疫功能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，比如分泌某些可溶性因子直接抑制B細(xì)胞增殖和趨化潛能［14］。

綜上所述，外周血T、B淋巴細(xì)胞過(guò)度活化可能促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病情發(fā)展。MSCs輸注作為有效的免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)的治療手段，其低免疫原性提高了同種異體移植的可能性，同種異體MSCs移植均不引起淋巴組織增殖反應(yīng)［15］，且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，臨床應(yīng)用方便，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病領(lǐng)域中有著良好的前景。