外源性膽汁酸恢復(fù)膽道外引流導(dǎo)致的肝再生障礙及其機(jī)制

謝經(jīng)豐 范基元 袁晟光

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰外科（廣西桂林 541001）

臨床上各種原因引起的梗阻性黃疸比較常見，如肝門部膽管癌（hilar cholangiocarcinoma，HC）、肝內(nèi)膽管結(jié)石等，由于肝臟儲(chǔ)備功能較差，常常對(duì)此類患者進(jìn)行肝部分切除術(shù)（partial hepatectomy，PH）前的膽道引流［1］。無論是術(shù)前膽道引流（per?cutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD）內(nèi)外聯(lián)合引流術(shù)還是單純外引流術(shù)，術(shù)后血清總膽紅素均下降迅速。能有效地解除梗阻性黃疸［2］。但是，研究發(fā)現(xiàn)外引流后會(huì)導(dǎo)致肝切除術(shù)后肝再生缺陷，術(shù)后肝衰風(fēng)險(xiǎn)加大，肝臟恢復(fù)能力較未引流組差［3］。外引流導(dǎo)致肝部分切除術(shù)后肝再生障礙的機(jī)制普遍被歸于外引流打破了膽汁酸的腸肝循環(huán)繼而影響術(shù)后肝再生。外引流術(shù)在臨床被普遍采用而術(shù)后肝再生障礙又不可避免。但是外引流導(dǎo)致術(shù)后肝再生障礙機(jī)制尚不清楚［3］。HUANG等［4］證明膽道外引流同時(shí)補(bǔ)充0.2%外源性的CA飲食組較未補(bǔ)充外源性CA組能加速肝再生。但是，補(bǔ)充外源性膽汁酸可以恢復(fù)膽道外引流導(dǎo)致的肝再生障礙的具體機(jī)制尚不完全清楚。

研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸與其受體法尼酯X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）結(jié)合傳遞信號(hào)，在肝臟的損傷、修復(fù)中起重要作用。膽汁酸-FXR信號(hào)通路是正常肝再生所必需，通過膽汁酸的腸肝循環(huán)調(diào)節(jié)膽汁酸池的大小，將膽汁酸池維持在一個(gè)恒定的量［4］。肝臟表達(dá)的FXR和腸道FXR在肝損傷后的肝再生中都起作用，然而肝臟和腸道的FXR在肝再生過程所起的作用及相關(guān)作用機(jī)制是不一樣的。肝臟通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead box M1b，F(xiàn)oxm1b）的表達(dá)，而腸粘膜通過誘導(dǎo)FGF15（人類是FGF19）的表達(dá)調(diào)控肝再生［5］。那么外引流后腸道FGF15的表達(dá)情況會(huì)發(fā)生怎樣變化，補(bǔ)充外源性膽汁酸會(huì)不會(huì)恢復(fù)腸道FGF15的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 健康雄性SD大鼠90只，體重約250 g左右，由湖南斯萊克景達(dá)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；膽汁酸購自Sigma公司（編號(hào)1001700885）；大鼠Ki?67抗體購自Abcam公司（編號(hào)ab1677767）；總RNA提取試劑盒（Tiangen公司，DP419）；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（Tiangen公司，KR103）；FGF15抗體購自LifeSpan BioSciences公司（產(chǎn)品編號(hào)LS?B15011?100）。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將90只雄性健康SD大鼠隨機(jī)分為3組：未引流組（n=30）、外引流（ED組，n=30）、外引流同時(shí)補(bǔ)充外源性0.2%CA組（ED+0.2%CA組）。

未引流組：開腹分離小段膽總管，不引流，實(shí)驗(yàn)第7天行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

ED組：開腹分離小段膽總管，剪開小口，插入引流管，固定引流管，引流管另一端從腹腔引出行走皮下，在大鼠頸部引出固定，可以有效防止大鼠撕咬引流管，引流7 d后，行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

ED+0.2%CA組：ED模型建成后，每天給予一次3 mL 0.2%外源性CA，灌胃7 d后，行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 大鼠肝組織Ki?67表達(dá)檢測(cè) 免疫組化S?P法檢測(cè)Ki?67表達(dá)。高倍視野下選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)肝細(xì)胞中Ki?67陽性細(xì)胞（細(xì)胞核染成棕黃色為陽性）所占的百分比。

1.3.2 大鼠回腸組織FGF15 mRNA表達(dá)檢測(cè) 回腸組織經(jīng)液氮研磨后，提取肝臟總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃5 min延伸；GAPDH的反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃40 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃5 min延伸。所得產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下拍照，Image J分析軟件測(cè)定目的條帶的灰度值，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值即為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)所需引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。大鼠FGF15上游引物：5′?GTGTCGGATGA?AGGTCCACT?3，下游引物：5′?AGTCCACAGAGCC?GTCACTC?3′；GAPDH上游引物：5′?GAGGGAAAT?CGTGCGTGAC?3′，下游引物：5′?CTGGAAGGTGGA?CAGTGAG?3′。

1.3.3 大鼠回腸組織FGF15蛋白檢測(cè) 組織細(xì)胞裂解液中加入100∶1的PMSF提取回腸蛋白，參照試劑說明書，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗4℃過夜，TBST緩沖液洗滌后加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h。暗室顯影定影后掃描記錄，Image J分析軟件測(cè)定目的條帶的灰度值。目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值即為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟 Ki?67陽性表達(dá)率 肝部分切除術(shù)后，ED組與ED+0.2%CA組和未引流組相比，Ki?67表達(dá)水平在48 h和72 h明顯降低（P＜0.05），ED+0.2%CA組與未引流組相比，Ki?67水平在48 h明顯降低（P＜0.05），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他時(shí)間點(diǎn)（P＞0.05），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1、圖1）。

2.2 回腸FGF15 mRNA及蛋白水平情況 ED組FGF15 mRNA及蛋白在肝部分切除術(shù)后時(shí)各時(shí)段表達(dá)水平較弱，明顯低于ED+0.2%CA組和未引流組（P＜0.05），F(xiàn)GF15 mRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的總體趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到高峰，峰值較ED+0.2%CA組和未引流組明顯偏低（P＜0.05）。而ED+0.2%CA組的FGF15蛋白及mRNA各時(shí)段的表達(dá)明顯低于未引流組，峰值較未引流組明顯偏低（P＜0.05）（表2、3，圖2、3）。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)肝切除術(shù)后Ki?67表達(dá)情況Tab.1 Positive expression rate of Ki?67 at different time points in each group（n=5）±s，%

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)肝切除術(shù)后Ki?67表達(dá)情況Tab.1 Positive expression rate of Ki?67 at different time points in each group（n=5）±s，%

注:*與ED+0.2%CA組同時(shí)段比較，P＜0.05；#與未引流組同時(shí)段比較，P＜0.05

組別ED組ED+0.2%CA組未引流組25.62±1.79 24.12±2.85 23.35±2.43 55.39±9.32 48.67±5.64 58.25±8.56 62.16±6.65*78.76±7.43#91.43±8.65 42.65±7.21*56.87±6.43 78.56±7.37 0 h 24 h 48 h 72 h

圖1 各組肝切除術(shù)后肝臟組織Ki?67表達(dá)情況（免疫組化×400）Fig.1 The expression of Ki?67 of liver tissue after hepatectomy（Immunohistochemistry ×400）

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)回腸FGF15 mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=5）Tab.2 Relative expression levels of FGF15 mRNA at different time points in ileum tissue of each group ±s，%

注：*與ED+0.2%CA組比較，P＜0.05；#與未引流組比較，P＜0.05

組別ED組ED+0.2%CA組未引流組0 h 0.30±0.15*0.37±0.17#1.06±0.13 4 h 0.33±0.21*0.40±0.18#1.19±0.23 12 h 0.39±0.25*0.73±0.26#1.21±0.24 24 h 0.56±0.26*1.02±0.28#1.65±0.29 48 h 0.50±0.19*0.85±0.18#1.27±0.25 72 h 0.33±0.21*0.78±0.10#1.32±0.15

圖2 各組大鼠肝部分切除術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)回腸組織FGF15 mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.2 The relative quantitative expression of FGF15 mRNA in ileum after hepatectomy

圖3 各組大鼠肝部分切除后各時(shí)間點(diǎn)回腸組織FGF15蛋白的相對(duì)表達(dá)Fig.3 The relative quantitative expression of FGF15 protein in ileum after hepatectomy

3 討論

擴(kuò)大范圍手術(shù)切除是肝門部膽管癌患者獲得長期生存的唯一有效手段，這些患者術(shù)前往往合并有梗阻性黃疸增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)［6］。術(shù)前膽道引流減黃可以改善患者肝功能提高手術(shù)耐受力降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)而被廣泛采用［7］。研究表明，膽道外引流對(duì)肝部分切除術(shù)后肝再生有明顯抑制作用，術(shù)后肝衰風(fēng)險(xiǎn)加大，病死率增高［8］。膽道外引流導(dǎo)致肝再生障礙機(jī)制尚不完全明了，如何克服膽道外引流導(dǎo)致的肝部分切除術(shù)后肝再生障礙是該領(lǐng)域尚未解決的關(guān)鍵問題，因而本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于模擬肝門部膽管癌手術(shù)過程，建立大鼠膽道外引流后肝部分切除動(dòng)物模型，闡述膽道外引流導(dǎo)致肝再生障礙的可能機(jī)制，同時(shí)觀測(cè)動(dòng)物模型灌胃補(bǔ)充生理濃度外源性膽汁酸能糾正術(shù)后肝再生障礙，闡述膽汁酸信號(hào)通路在膽道外引流導(dǎo)致肝再生障礙及肝細(xì)胞增殖的作用重要性，為臨床外引流策略法提供理論依據(jù)。

FGF15是FGFs家族的一員，高表達(dá)在小腸，主要是回腸，在肝臟不表達(dá)。膽汁酸通過激活大鼠腸道FXR促進(jìn)肝再生，腸道FXR激活FGF15，F(xiàn)GF15通過門靜脈循環(huán)到肝臟，抑制膽汁酸合成［9］。在小鼠模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)肝部分切除后FGF15缺失的小鼠肝損傷和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高，并伴有肝臟膽汁酸的升高［10-11］。FGF15基因敲除鼠表現(xiàn)肝臟再生延遲［12］。外源性的加入FGF15可以恢復(fù)腸道特異性FXR缺失和機(jī)體FXR敲除小鼠的肝損傷缺陷。腸道FXR和它誘導(dǎo)分子FGF15在肝臟保護(hù)過程中有重要的作用［13］。

膽汁酸在肝臟的合成受肝臟、腸道FXR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，被膽汁酸激活的肝臟FXR誘導(dǎo)小分子異源二聚體伴侶（short heterodimer partner，SHP）的表達(dá)，SHP抑制CYP7A1的表達(dá)［14］。在小鼠模型中，缺乏SHP會(huì)增加CYP7A1的表達(dá)［15-16］?；啬c分泌的FGF15通過門靜脈到達(dá)肝臟與其受體FGFR4結(jié)合，后者通過激活下游分子的磷酸化來抑制膽汁酸合成的限速酶CYP7A1，CYP7A1的低表達(dá)可以防止殘肝膽汁酸負(fù)荷過高，從而對(duì)肝再生有益［17-18］。本研究結(jié)果顯示：肝切除術(shù)后，ED組FGF15蛋白和mRNA在肝部分切除術(shù)后時(shí)各時(shí)段表達(dá)水平較弱，明顯低于ED+0.2%CA組和未引流組（P＜0.05），F(xiàn)GF15蛋白及mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的總體趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到高峰，峰值較ED+0.2%CA組和未引流組明顯偏低（P＜0.05）。ED+0.2%CA組FGF15蛋白及mRNA各時(shí)段表達(dá)明顯低于未引流組，肝部分切除術(shù)后FGF15 mRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的總體趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到高峰，峰值較未引流組明顯偏低（P＜0.05）肝切除術(shù)后，ED組與ED+0.2%CA組和未引流組相比，肝組織增殖細(xì)胞核抗原（Ki?67）表達(dá)水平在48、72 h時(shí)間點(diǎn)明顯降低，ED+0.2%CA組與未引流組相比，肝組織增殖細(xì)胞核抗原（Ki?67）水平在48 h時(shí)間點(diǎn)明顯降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其原因可能是ED組阻斷了膽汁酸的腸肝循環(huán)，導(dǎo)致FXR表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步影響了腸道FGF15的表達(dá)，SHP表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致CYP7A1活性增強(qiáng)，肝內(nèi)膽汁酸池含量增加，損害肝功能，進(jìn)而延遲肝再生。當(dāng)以外源性0.2%CA灌胃后，恢復(fù)了部分膽汁酸的刺激，使得腸道FGF15的表達(dá)增高，SHP表達(dá)上調(diào)，一定程度上抑制CYP7A1的活性，減輕了肝臟的膽汁酸負(fù)荷，在一定程度上促進(jìn)了肝再生。

本研究結(jié)果證實(shí)，外源性膽汁酸可以恢復(fù)外引流引起的肝再生障礙，這種作用可能是通過激活腸道FGF15受體實(shí)現(xiàn)的。