4-羥苯基維胺對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA表達(dá)的影響

南美蘭 金玟言 金哲虎 金承龍

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科（吉林延吉 133000）

瘢痕疙瘩（keloid）是人體皮膚創(chuàng)傷后異常修復(fù)的結(jié)果［1-2］，真皮部位以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞過度增殖，合成大量膠原、纖維連接蛋白及糖蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成與降解失去平衡，造成瘢痕形成異常［3］。

Ⅰ型膠原是ECM中最主要的成分之一，除自身的生理支持作用外，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移與增殖，是創(chuàng)面愈合和瘢痕形成的關(guān)鍵因素。瘢痕疙瘩主要表現(xiàn)為Ⅰ型膠原特異性表達(dá)升高，在對(duì)治療瘢痕疙瘩有效藥物的深入研究中，大多離不開對(duì)膠原基因表達(dá)的影響?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs）是調(diào)節(jié)ECM成分合成和降解的重要分子［4-5］?；|(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metallo?protein?1，MMP?1）是MMPs家族的重要一員，在創(chuàng)傷愈合過程中對(duì)啟動(dòng)膠原的降解起著關(guān)鍵作用，是Ⅰ型膠原降解的關(guān)鍵酶。

4-羥苯基維胺（4?hydroxyphenyl?retinamide，4?HPR）是人工合成的全反式維甲酸，在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞有較高的抗腫瘤活性，且毒性低于其他維甲酸類藥物［6］。因瘢痕疙瘩具有腫瘤的生物學(xué)特性［7］，筆者推測(cè) 4?HPR也可用于瘢痕疙瘩的治療。

前期研究中筆者發(fā)現(xiàn)，在人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，4?HPR可以抑制Ⅰ型前膠原（typeⅠ pro?collagen，ProcollagenⅠ）及上調(diào)MMP?1蛋白的表達(dá)。為此，筆者本次進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，探討在RNA水平上，4?HPR的干預(yù)下對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的ProcollagenⅠ及MMP?1表達(dá)的影響。進(jìn)一步明確4?HPR對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制，為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 胎牛血清（Corning公司）、DMEM培養(yǎng)液（Corning公司）、Ⅱ型膠原酶（Gibco公司）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ染料法熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）、4?HPR（南京圣賽化工有限公司）、二甲基亞砜（Sigma公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱（Thermo Fisher Scientific公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、PCR儀器（Life Technologies公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人瘢痕疙瘩及正常真皮成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) 成纖維細(xì)胞來源于瘢痕疙瘩組織（臨床病理證實(shí)，已取得了患者知情同意，未接受局部外用藥物、注射及放射治療且無其他自身免疫性疾病及慢性器質(zhì)性疾?。┘罢Ｆつw組織（已取得了患者知情同意，而且所取標(biāo)本的顏色和形態(tài)均正常，無瘢痕、炎癥及其他病變）。將臨床切取的標(biāo)本在無菌條件下經(jīng)漂洗、消毒，放入干燥的無菌培養(yǎng)皿中，切成1 cm×1 cm大小的碎片，放入含2 mL胰酶的離心管中4℃冷消化。冷消化24 h、熱消化15～20 min后，遂將離心管內(nèi)胰酶和組織一同倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕撕去表皮。將已去除表皮的皮片剪碎至1 mm×1 mm左右大小，加入2～3 mLⅡ型膠原酶，置入CO2恒溫培養(yǎng)箱中，消化5～7 h。取上清液移至另一離心管中離心，去上清，加入原代培養(yǎng)基吹打混勻，轉(zhuǎn)入到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察，可觀察到大量貼壁多角型細(xì)胞和黑色組織碎屑，碎屑周圍有細(xì)胞爬出，且細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，給細(xì)胞換液，用PBS液將碎屑沖洗干凈，然后加入培養(yǎng)液在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每日換液，待細(xì)胞基本鋪滿瓶底后，且生長(zhǎng)成致密單層時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取6～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制 稱取20 mg 4?HPR，加入1 mL DMSO溶解，-20℃避光保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)瘢痕疙瘩和正常成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達(dá)水平 35 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞待80%～90%融合，消化、離心、徹底棄上清液，每孔加0.5～1.0 mL Trizol，混勻，室溫放置5 min使細(xì)胞充分裂解，收集細(xì)胞和裂解液。每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿，混勻，靜置5 min抽提RNA，4℃，15 000 r/min，離心15 min。小心取水相RNA溶解層，加0.5 mL異丙醇，混勻后靜置10 min，沉淀RNA，4℃，15 000 r/min，離心10 min。棄上清，加1 mL的70%乙醇洗滌，4℃，15 000 r/min，離心5 min。棄上清，開蓋自然干燥后加入15～30 μL無RNase的DDW，溶解RNA。用超微量核酸定量?jī)x直接測(cè)定核酸濃度，加2 μL RNase free DDW于點(diǎn)樣板進(jìn)行調(diào)零，加2 μL RNA原液測(cè)量，程序算出樣品的260、280、230 nm的吸光度和RNA濃度、A260/A280及A260/A230，導(dǎo)出結(jié)果，標(biāo)記、-80℃保存。按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，目的基因ProcollagenⅠ、MMP?1和內(nèi)參GAPDH基因同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因Pro?collagenⅠ、MMP?1和內(nèi)參GAPDH基因的引物序列設(shè)計(jì)經(jīng)基因庫(kù)查詢，均由上海Invitrogen有限公司合成，序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性22 s，58℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后采用2?△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

表1 引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.1 Primersequences，annealing temperatures and products size of target genes

1.2.4 不同濃度4?HPR對(duì)瘢痕疙瘩纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1mRNA表達(dá)水平的影響對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別以1、3、6 μmol/L的4?HPR溶液加入長(zhǎng)滿90%的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（饑餓24 h）中，分別作用24 h后，抽提RNA，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，樣本比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察結(jié)果 成纖維細(xì)胞第5～8天開始見有少量細(xì)胞開始從組織中游出，并逐漸增多，直至第20～30天細(xì)胞可基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底可進(jìn)行傳代。瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，其形態(tài)上無明顯差異。見圖1。

圖1 顯微鏡下成纖維細(xì)胞形態(tài)（×10）Fig.1 Morphology of fibroblasts observed under inverted micro?scope（× 10）

2.2 瘢痕疙瘩和正常成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1mRNA的表達(dá)水平 結(jié)果示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠmRNA表達(dá)明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.88，P＜0.05），而瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP?1mRNA表達(dá)低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.22，P＜0.05）。見圖2。

圖2 成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達(dá)Fig.2 The expression of Procollagen Ⅰand MMP?1 mRNA in fibroblasts

2.3 不同濃度4?HPR作用下瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA表達(dá)的比較在原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，不同濃度的4?HPR藥物處理組（實(shí)驗(yàn)組）中，隨著濃度的增高ProcollagenⅠmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減少，即4?HPR對(duì)ProcollagenⅠmRNA表達(dá)呈明顯的量效抑制，6 μmol/L時(shí)作用最強(qiáng)，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=3.18，P1＜ 0.05；t2=3.87，P2＜0.05；t3=5.34，P3＜ 0.05）。而 MMP?1 mRNA 表達(dá)水平，隨著4?HPR藥物濃度的增高較對(duì)照組明顯增加，6 μmol/L藥物濃度時(shí)作用最強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=5.18，P1＜ 0.05；t2=5.60，P2＜ 0.05；t3=7.86，P3＜ 0.01）。見圖3。

圖3 比較4?HPR不同濃度對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達(dá)Fig.3 Comparing the expression of ProcollagenⅠand MMP?1 mRNA in keloid fibroblasts in different concentrations of 4?HPR

3 討論

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷的過度修復(fù)，是人類特有的一種良性皮膚纖維增殖性腫瘤，以細(xì)胞因子活性異常增強(qiáng)和產(chǎn)生大量的ECM為主要組織學(xué)特點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［8-9］。最顯著的特征表現(xiàn)為膠原、纖維連接蛋白和蛋白糖原等ECM過度合成，降解減少，在局部大量沉積。

本研究結(jié)果表明，在原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，ProcollagenⅠ的基因表達(dá)明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞（P＜0.05），而此類型前膠原屬于原纖維化膠原類，ProcollagenⅠ基因表達(dá)升高導(dǎo)致其蛋白含量增多，可能是瘢痕疙瘩形成的原因之一，其作用可能與其他類型膠原的聚集以及膠原纖維與胞外基質(zhì)作用有關(guān)。

近年來，膠原蛋白合成與降解間的失衡在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用引起重視，隨之關(guān)于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMPs家族的檢測(cè)也成為研究的熱點(diǎn)課題。MMPs是一群因具有蛋白水解酶活性參與降解基底膜和ECM過程的家族。MMPs家族按作用底物的特異性和在細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行分類，已被發(fā)現(xiàn)的成員有5大類，均具有相對(duì)保守的基因結(jié)構(gòu)和酶活性。MMP?1為其家族成員之一，它可以在創(chuàng)傷修復(fù)中Ⅰ型前膠原a1和a2鏈的特殊部位降解膠原，是降解膠原纖維最主要的基質(zhì)金屬蛋白酶。筆者在本次研究中，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析MMP?1基因表達(dá)結(jié)果顯示，體外原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，其MMP?1 mRNA表達(dá)較正常皮膚成纖維細(xì)胞顯著降低（P＜0.05），結(jié)果與張鵬等［10］、UCHID 等［11］及龐久玲等［12］結(jié)論相符，提示可能瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞自身存在著MMP?1轉(zhuǎn)錄及/或翻譯水平的異常，致使瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞胞核、胞漿中MMP?1蛋白減少。

4?HPR是20世紀(jì)60年代美國(guó)開發(fā)合成的一種維甲酸衍生物。4?HPR已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的體內(nèi)外研究，在臨床試驗(yàn)中亦顯示出良好的抗腫瘤作用，且人體對(duì)其有良好的耐受性［13-15］，是一種具有良好臨床應(yīng)用前景的腫瘤預(yù)防和治療藥物。瘢痕疙瘩表現(xiàn)出向周圍正常皮膚組織侵襲性生長(zhǎng)、無自愈傾向、單純手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)、對(duì)放療和化療敏感等類腫瘤特性［16-19］，且研究［20］顯示眾多腫瘤相關(guān)基因及細(xì)胞因子在瘢痕疙瘩的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，這些都提示在瘢痕疙瘩的治療研究中可借鑒一些抗腫瘤的研究成果。本次研究，筆者用不同濃度的4?HPR處理原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增高，實(shí)驗(yàn)組的ProcollagenⅠmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減少，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)組的MMP?1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與筆者前期在蛋白水平上4?HPR對(duì)ProcollagenⅠ及MMP?1影響的研究結(jié)果相一致［21］。

本次研究表明，4?HPR能阻斷ProcollagenⅠmRNA表達(dá)或抑制其生物活性，且對(duì)MMP?1 mRNA有增強(qiáng)作用，達(dá)到實(shí)驗(yàn)性治療瘢痕疙瘩的目的。而且，4?HPR具有濃度依賴性的降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的ProcollagenⅠmRNA及增加MMP?1 mRNA的表達(dá)，致使更有效地抑制成纖維細(xì)胞增殖，給瘢痕疙瘩的治療帶來較好的發(fā)展前景。