組蛋白去乙?；?在異氟烷預(yù)處理抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的作用

郭欣瑩 鄭彬 阮祥才

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市第一人民醫(yī)院麻醉科（廣州 510180）

異氟烷，作為臨床上廣泛使用的吸入麻醉藥物，具有免疫調(diào)節(jié)作用。有研究［1-2］表明，異氟烷可以降低中性粒細(xì)胞的活性，抑制巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子［3］，減弱自然殺傷細(xì)胞對干擾素的反應(yīng)［3-4］等。異氟烷預(yù)處理，是一種與缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）類似的現(xiàn)象，具有抗炎和保護缺血/再灌注損傷效應(yīng)［5］。在圍手術(shù)期，由麻醉、手術(shù)等刺激而引起的炎癥反應(yīng)是常見的臨床現(xiàn)象。研究［4］發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，異氟烷預(yù)處理能降低單核?巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，并有效改善急性呼吸窘迫綜合征和急性肺損傷大鼠的癥狀［6-7］。然而，異氟烷預(yù)處理對機體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制仍不明確。

近年來研究［8］表明，疾病的發(fā)生、發(fā)展、環(huán)境因素（如飲食習(xí)慣、藥物、吸煙）都能引起表觀遺傳學(xué)機制的改變。而異氟烷等吸入麻醉藥的免疫調(diào)節(jié)作用與表觀遺傳學(xué)修飾之間具有密切的關(guān)系。其中，異氟烷可對組蛋白的乙?；揎椇徒M蛋白去乙?；府a(chǎn)生不同程度的影響，進(jìn)而影響其對靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，最終造成神經(jīng)炎癥或認(rèn)知功能發(fā)育障礙［9-11］。有相關(guān)研究［12-13］表明，HDAC4在組蛋白乙?；揎椪{(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。在血管平滑肌細(xì)胞中，TNF?α能促進(jìn)HDAC4核轉(zhuǎn)位，激活ROS介導(dǎo)NF?κB信號通路，從而調(diào)節(jié)血管炎癥。而利用siRNA技術(shù)在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)干擾HDAC4的表達(dá)，能抑制TNF?α介導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附、VCAM?1表達(dá)、NF?κB信號通路和ROS的產(chǎn)生，從而抑制高血壓的發(fā)生和發(fā)展［13］。因此筆者推測HDAC4可能是異氟烷預(yù)處理調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中的重要靶點之一。

本研究擬觀察內(nèi)毒素刺激對人單核細(xì)胞HDAC4核轉(zhuǎn)位的影響，以及異氟烷預(yù)處理的相應(yīng)效果，將有助于明確異氟烷預(yù)處理抗炎和HDAC4核轉(zhuǎn)位的關(guān)系和初步機制，為圍手術(shù)期吸入麻醉藥的合理使用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 THP?1細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司。異氟烷（ISO）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。核漿蛋白提取試劑盒購自美國Thermo公司。MTS法細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司。人TNF?α Quantikine ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。兔抗人HDAC4抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP?1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。按需要把處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到不同體積的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組 把處于對數(shù)生長期的THP?1細(xì)胞隨機分為不同的處理組。將THP?1細(xì)胞放置于自制的密封的吸入麻醉藥設(shè)備中進(jìn)行預(yù)處理。異氟烷預(yù)處理組的氣體條件設(shè)置為異氟烷1.5%、5%CO2、21%O2、其余用N2的混合氣體填充。對照組使用含有 5%CO2、21%O2、74%N2的混合氣體進(jìn)行處理。根據(jù)相應(yīng)組別設(shè)置異氟烷預(yù)處理時間。之后在相應(yīng)組別中加入脂多糖（400 ng/mL）并置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理18 h。

1.2.3 ELISA檢測細(xì)胞上清TNF?α的變化 將處理后的THP?1細(xì)胞用3 000 r/min，4℃離心15 min后提取上清。采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清中TNF?α的變化。首先根據(jù)說明書方法配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測定的OD值算出相應(yīng)的TNF?α濃度。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 根據(jù)核漿蛋白提取試劑盒說明書，分別提取細(xì)胞的核蛋白和胞漿蛋白。采用Western blot檢測HDAC4的表達(dá)。BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品分別設(shè)置相關(guān)參數(shù)進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜實驗。轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h。將一抗稀釋成一定的濃度（1∶1 000），并加入PVDF膜上，4℃搖床過夜。第二天用相應(yīng)二抗（1∶5 000），在室溫孵育1 h。用ECL顯影液進(jìn)行顯影。用ImageJ軟件計算目的條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.5 MTS檢測細(xì)胞活力的改變 取100 μL已處理和未處理的THP?1細(xì)胞培養(yǎng)液到96孔板中，再在每個孔中加入20 μL MTS試劑。置于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中孵化2 h。取出后用562 nm比色，記錄所測樣品的吸光值。分別取得已處理和未作處理的細(xì)胞的吸光度作比值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism7對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間總體均數(shù)比較使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的脂多糖對TNF?α的釋放和細(xì)胞活力的影響 脂多糖濃度為400 ng/mL時，細(xì)胞上清中TNF?α的濃度達(dá)到最高（P＜0.01）（圖1A）。同時，結(jié)果顯示脂多糖濃度為1 500 ng/mL時，細(xì)胞活力明顯降低（P＞0.05）（圖1B）。因此，筆者選取脂多糖濃度為400 ng/mL作為后續(xù)實驗的劑量。

圖1 各組細(xì)胞中TNF?α釋放和細(xì)胞活力的變化Fig.1 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

2.2 不同的異氟烷預(yù)處理時間對脂多糖誘導(dǎo)的TNF?α的釋放和細(xì)胞活力的影響 與0 min的異氟烷預(yù)處理相比，6和12 h的異氟烷預(yù)處理能有效抑制TNF?α的釋放（P＜0.01）（圖2A）。12 h的異氟烷預(yù)處理后再加入脂多糖（400 ng/mL）刺激THP?1細(xì)胞18 h，細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）（圖2B）。因此筆者選取6 h的異氟烷（1.5%）預(yù)處理作為后續(xù)實驗的處理時間。

2.3 異氟烷預(yù)處理能抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子釋放 與對照組相比，LPS組能明顯促進(jìn)細(xì)胞分泌炎癥因子，TNF?α 的表達(dá)增加2.31倍（P＜0.01）。與LPS組相比，ISO+LPS組內(nèi)THP?1細(xì)胞釋放的TNF?α出現(xiàn)一定程度的降低（P＜ 0.05）（圖3）。

圖2 各組細(xì)胞中TNF?α釋放和細(xì)胞活力的變化Fig.2 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

圖3 各組細(xì)胞中TNF?α釋放和細(xì)胞活力的變化Fig.3 The releaes of TNF?α and cell viability in each group

2.4 異氟烷預(yù)處理能抑制脂多糖誘導(dǎo)HDAC4核轉(zhuǎn)位 與對照組相比，LPS組的核蛋白內(nèi)HDAC4明顯增加（P＜0.01），但胞漿蛋白的HDAC4降低（P＜0.05）；而ISO組的胞漿蛋白較對照組中HDAC4表達(dá)增高。LPS+ISO組的核蛋白較LPS組內(nèi)HDAC4表達(dá)顯著降低（P＜0.01），胞漿蛋白的HDAC4增加（P＜ 0.05）（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞中HDAC4表達(dá)變化Fig.4 The expression of HDAC4 in each group

3 討論

異氟烷作為目前臨床上被廣泛使用的吸入麻醉藥之一，在全身麻醉的誘導(dǎo)及維持過程中占據(jù)主導(dǎo)地位。有研究表明異氟烷預(yù)處理能抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的釋放。CHUNG等［14］發(fā)現(xiàn)，異氟烷預(yù)處理對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷起保護作用，它可以通過抑制NF?κB信號通路的激活，從而減少炎癥因子TNF?α，IL?6和IL?1β的釋放。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，1.5%異氟烷預(yù)處理6 h能有效抑制炎癥因子的釋放。這些結(jié)果表明，異氟烷預(yù)處理確實具有抑制炎癥因子釋放的能力。因此，在圍手術(shù)期，嚴(yán)重外傷、重大手術(shù)創(chuàng)傷、休克、感染后的病人使用異氟烷預(yù)處理可能具有潛在的臨床意義。

炎癥反應(yīng)屬于臨床上常見的一個病理生理過程，有多種機制參與，現(xiàn)有廣泛研究證實染色質(zhì)介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)節(jié)在其中發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用［15］。其中組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學(xué)中一種常見形式，它主要由HATs和HDACs共同調(diào)節(jié)。而特定的組蛋白去乙酰化酶（HDACs）能與不同的信號通路相互作用并調(diào)節(jié)其生物活性。在糖尿病腎病大鼠模型中，WANG的團隊［15］分別檢測了HDAC1?11在腎臟中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HDAC4和HDAC5在腎臟中表達(dá)明顯增高，而其中HDAC4與NF?κB信號通路的激活有密切關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)丙戊酸能通過抑制HDAC4的表達(dá)，從而抑制組蛋白H3和H4的乙?；?，導(dǎo)致TNF?α等炎癥因子減少起抗炎作用，從而對腎臟起保護作用［15-16］。值得注意的是，IIa類HDACs包括HDAC4、HDAC5和HDAC7，其中HDAC4在巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)［17］。因此，筆者猜測HDAC4在異氟烷預(yù)處理抑制炎癥因子的過程中起重要作用。筆者分別提取THP?1細(xì)胞的核蛋白、胞漿蛋白和總蛋白檢測HDAC4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)：在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，THP?1細(xì)胞中核蛋白HDAC4明顯增加，而胞漿蛋白中HDAC4減少；但異氟烷預(yù)處理后的THP?1細(xì)胞中核蛋白的HDAC4明顯降低，而胞漿蛋白中HDAC4增加；同時總蛋白的HDAC4表達(dá)無明顯變化。有研究［15］表明，高糖能誘導(dǎo)足突細(xì)胞中HDAC4進(jìn)入細(xì)胞核，抑制STAT1啟動子區(qū)域的乙?；?，從而調(diào)節(jié)炎癥凋亡等過程。因此，筆者認(rèn)為在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，THP?1細(xì)胞中的HDAC4核轉(zhuǎn)位激活炎癥相關(guān)的信號通路，從而促進(jìn)下游炎癥因子的釋放；相反，異氟烷預(yù)處理后再給予脂多糖刺激THP?1細(xì)胞，則誘導(dǎo)HDAC4從細(xì)胞核到胞漿，抑制炎癥相關(guān)的信號通路。在整個過程中，HDAC4的表達(dá)并無明顯改變，異氟烷預(yù)處理是通過誘導(dǎo)HDAC4在胞核?胞漿移動，從而調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放。本研究的創(chuàng)新點在于首次從組蛋白乙?；揎椀慕嵌忍接懏惙轭A(yù)處理抑制炎癥因子的潛在機制，但仍需進(jìn)一步實驗明確不同的HDACs在異氟烷預(yù)處理中的作用。

綜上所述，本研究證明了HDAC4在異氟烷預(yù)處理抑制炎癥因子中的作用。結(jié)果提示，異氟烷預(yù)處理通過抑制HDAC4核移位，從而抑制HDAC4介導(dǎo)的炎癥因子釋放。但目前，關(guān)于HDACs在異氟烷預(yù)處理中的作用研究仍處于起步階段，其對生物學(xué)行為調(diào)控的具體機制仍未完全闡明，仍需進(jìn)一步的實驗研究。