促紅細胞生成素預處理對離體血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注模型中內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達的影響

王源江 李紅戈 趙振強 王埮 李嫚 陳志斌

1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（海口 570102）；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（武漢 430022）

近年來，急性缺血性腦卒中是全世界死亡的最常見原因，溶栓及血管內(nèi)治療是主要的治療方法，但有部分患者治療后導致腦缺血/再灌注損傷（I/R），使預后惡化，出現(xiàn)更嚴重的神經(jīng)損傷和身體功能缺損或殘疾［1-2］。腦缺血/再灌注損傷（I/R），包括有一氧化氮（nitric oxide，NO）自由基的產(chǎn)生、氧化應激作用、興奮性氨基酸毒性作用及細胞內(nèi)鈣超載，促使大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放，導致細胞凋亡的發(fā)生［3］。有研究結(jié)果表明，患者可通過缺血預適應（ischemic preconditioning，IPC）降低腦缺血/再灌注損傷（I/R）。IPC是體內(nèi)最強大的保護機制，是一種多元性細胞防御現(xiàn)象，即預先反復短暫缺血可延緩或減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現(xiàn)象［4］。但臨床上給予可能的腦梗死患者一次短暫性缺血進行預處理是不現(xiàn)實的。

隨著對缺血耐受現(xiàn)象研究的深入，有研究［5-6］表明，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）可降低I/R，EPO是一種可被誘導的多功能細胞因子超家族成員，通過促進紅系祖細胞分裂分化為成熟的紅細胞，維持體內(nèi)紅細胞數(shù)量的動態(tài)平衡，從而對缺氧情況下的多種器官起到有保護作用。然而，德國相關(guān)研究報道，對成人中腦動脈中風后采取的隨機、雙盲、安慰劑對照分組，應用大劑量重組人紅細胞生成素（recombinant human erythropoie?tin，rhEPO）治療，此治療對患者有效，但結(jié)果顯示了rhEPO未引起紅細胞的明顯增多，是否通過對NOS表達的影響所致，目前研究太少，具體機制尚不清楚［7］。

在本研究中，通過培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞（vascu?lar endothelial cells，VECs）并給予rhEPO預處理，建立離體缺血再灌注模型，檢測細胞活力及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase?3）的表達量，了解eNOS的表達情況，探討其中可能的作用機制，以此評估促紅細胞生成素預處理對血管內(nèi)皮細胞的缺血再灌注損傷是否具有保護作用，并為將來的藥物預處理預防缺血再灌注損傷尋找進一步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 重組人促紅細胞生成素（rhEPO）（沈陽三生制藥），人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（EA.hy926，華中科技大學同濟醫(yī)學院公共實驗平臺惠贈），碘化丙錠（DAPI）（美國Sigma），兔抗人eNOS、Caspase?3抗體（美國Santa Cruz）。

1.2 主要儀器 激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus）。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理 EA.hy926培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2及95%空氣恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單個人臍靜脈內(nèi)皮細胞時見細胞呈長梭形，融合生長時見細胞呈多角形為單層鋪路石排列，待細胞融合至70%用于實驗。

1.4 建立體外缺血再灌注損傷（I/R）模型 調(diào)整模擬缺血：去氧去糖，先以PBS洗細胞2遍，換Earle′s平衡鹽溶液，置于厭氧培養(yǎng)箱中6 h，持續(xù)通入95%N2+5%CO2，流量為0.5 L/min；模擬再灌注：復氧復糖，將細胞培養(yǎng)液換為不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于正常恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)18 h［8］。

1.5 細胞分組和預處理方法 （1）正常對照組：正常條件培養(yǎng)48 h；（2）單純I/R組：正常條件培養(yǎng)24 h，后模擬I/R；（3）rhEPO預處理組：含不同濃度（5、10、20 U/mL）rhEPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，后模擬I/R。

1.6 MTT比色法測細胞存活率 將對數(shù)生長期VECs分別按5×103個/孔接種于96孔板，接種后培養(yǎng)24 h，按分組處理細胞。處理結(jié)束后每孔加5 mg/mL MTT 20 μL孵育4 h，后加入150 μL DMSO，振蕩15 min后酶標儀測定490 nm處吸光度值，實驗重復3次。

1.7 Western blot檢測 取對數(shù)生長期，按分組處理后收集細胞，提取細胞總蛋白。測定蛋白濃度，按上樣量20 μg蛋白/孔于SDS?PAGE凝膠進行電泳分離，再轉(zhuǎn)至NC膜，并用5%BSA室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST清洗后加二抗室溫孵育1 h，然后ECL顯影，實驗重復3次。

1.8 免疫熒光檢測 取對數(shù)生長期的VECs，接種于置有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后按組別給予處理，后3.5%的多聚甲醛固定10 min，0.2%Triton X?100冰上破膜15 min，3%牛血清蛋白封閉抗原30 min，一抗4℃孵育過夜，次日予FITC二抗孵育1 h，DAPI染核后在激光共聚焦顯微鏡下拍照，實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0版軟件進行統(tǒng)計學分析，如為正態(tài)分布其方差齊，則采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法；如不服從正態(tài)分析或方差齊性，采用多個樣本秩和檢驗（Kruskal?Wallis，H檢驗），兩兩比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。假設(shè)檢驗采用雙側(cè)檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力檢測結(jié)果 對照組、I/R組和各rhE?PO預處理組的細胞存活率分別為100、38.2±1.5、57.1±5.8、67.6±6、74.5±6.9。見圖1。經(jīng)Kruskal?Wallis檢驗，差別有統(tǒng)計學意義（H=23.077，P＜0.001），各組表達水平經(jīng)兩兩比較，正常對照組、各rhEPO預處理組與I/R組表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各rhEPO預處理組組間表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組血管內(nèi)皮細胞存活率Fig.1 The cells survival rate of VECs in each group

2.2 eNOS和Caspase?3蛋白含量檢測

2.2.1 eNOS蛋白含量 對照組、I/R組和各rhEPO預處理組的eNOS蛋白水平分別為0.34±0.021、0.15 ± 0.034、0.51 ± 0.0304、0.64 ± 0.042、0.79 ±0.230。見圖2。經(jīng)Kruskal?Wallis檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（H=23.077，P＜0.001）。各組表達水平經(jīng)兩兩比較，正常對照組、rhEPO預處理組與I/R組表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各rhEPO預處理組組間表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組VECs的eNOS表達水平比較Fig.2 Comparison of eNOS protein expression in VECs of rates in each group

圖3 蛋白印跡法（Western?blot）檢測細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平Fig.3 Detected protein level of eNOS in cell by Western?blot

2.2.2 Caspase?3蛋白含量檢測 對照組、I/R組和各rhEPO預處理組的Caspase?3蛋白分別為0.21±0.024、0.79 ± 0.0624、0.65 ± 0.0349、0.53 ± 0.032、0.44 ± 0.0314。見圖4、圖5。經(jīng) Kruskal?Wallis檢驗，表達水平差異有統(tǒng)計學意義（H=23.077，P＜0.001）；各組表達水平經(jīng)兩兩比較，正常對照組與I/R組表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各rhEPO預處理組與I/R組表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各rhEPO預處理組間表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組VECs的Caspase?3表達水平比較Fig.4 Comparison of Caspase?3 protein expression in VECs of rates in each group

圖5 蛋白印跡法（Western?blot）檢測細胞中半胱氨酸蛋白酶3（Caspase?3）蛋白水平Fig.5 Detected protein level of Caspase?3 in cell by Western?blot

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞eNOS和Cas?pase?3的表達 I/R組細胞的eNOS表達量較正常對照組細胞降低，而各rhEPO預處理組提示eNOS表達較I/R組細胞明顯增強，且熒光強度隨著rhE?PO的濃度改變；Caspase?3的表達量則呈現(xiàn)完全相反的趨勢，I/R組細胞的表達量較正常對照組細胞明顯增強，而各rhEPO預處理組則出現(xiàn)下降，下降趨勢隨著rhEPO的濃度改變。見圖6、7。圖中的B組血管內(nèi)皮細胞胞漿中綠色熒光較A組明顯減弱，C、D、E這3組不同濃度rhEPO預處理后再模擬缺血再灌注后血管內(nèi)皮細胞胞漿中綠色熒光較B組明顯增強。見圖6。

血管內(nèi)皮細胞胞漿中綠色熒光較A組明顯增強，C、D、E這3組不同濃度rhEPO預處理后再模擬缺血再灌注后血管內(nèi)皮細胞胞漿中綠色熒光較B組明顯減弱。見圖7。

3 討論

缺血性再灌注后導致腦缺血/再灌注損傷，可激活nNOS產(chǎn)生一氧化氮（NO）［9］。NO是機體內(nèi)重要的信使分子和效應分子，是神經(jīng)信號傳遞和血管舒張等過程的內(nèi)源性介質(zhì)之一，對腦血管的神經(jīng)性支配的調(diào)節(jié)，在維持神經(jīng)元功能的完整性及腦血流恒定方面發(fā)揮重要作用［10-12］。NOS是一類含血紅素，包括分布在神經(jīng)元的神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）；分布在肝細胞、巨噬細胞、單核細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的誘導型一氧化氮合酶（iNOS）；分布血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）［13］。

多項研究表明，eNOS、EPO對腦血管均能起保護作用。NO的產(chǎn)生是誘導缺血耐受力（ischemic tolerance，IT）的關(guān)鍵因素，主要保護作用機制是，在腦缺血極早期（＜2 h），Ca2+內(nèi)流或腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體（TRAIL）通過PI3K/Akt通路誘導eNOS活性增強，所產(chǎn)生的NO可以激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC）提高環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平，擴張腦血管增加缺血區(qū)域血流、調(diào)控血小板聚集進而提供保護作用［14-16］。腦梗死早期（2～6 h）nNOS受Ca2+內(nèi)流的誘導過度表達，而腦缺血再灌注約6 h后iNOS受多種細胞因子、內(nèi)毒素及氧自由基（ROS）誘導，由DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表達，依賴細胞外L-精氨酸（L?Arg）的量，24 h達高峰，48 h開始下降，再灌注可使iNOS產(chǎn)生過量的NO，并與“呼吸爆發(fā)”后的大量ROS結(jié)合成ONOO-，降解為（OH-）及NO2損傷細胞，而且有實驗表明iNOS的激活會損傷eNOS生成NO的能力［17-19］。

EPO是HIF?1a的下游靶基因之一，腦缺氧時HIF?1a被激活，釋放EPO，從而發(fā)揮腦的作用［20］。其保護作用主要有：（1）上調(diào)抗氧化酶表達，增強抗氧化酶活性，減少氧自由基產(chǎn)生；（2）減少血管內(nèi)皮細胞凋亡；（3）通過EPOR直接作用于Ca2+通道，使之去極化抑制凋亡相關(guān)蛋白Caspase?3的合成而抗凋亡；（4）上調(diào)抗氧化酶的表達，增強CAT、SOD和GSH?PX等抗氧化酶的活性，并下調(diào)氧自由基產(chǎn)生，抑制平滑肌細胞內(nèi)iNOS表達，減少NO的過量產(chǎn)生［21-22］。其在腦組織內(nèi)與EPOR（EPO受體）結(jié)合后形成同源二聚體，致蛋白酪氨酸激2（Janus?tyrosine kinase?2，JAK?2）自身磷酸化激活［23］。而MARCEL等報道的氨基甲?；疎PO（CEPO）是一種沒有升血活性的神經(jīng)保護因子，在離體對腦中風、脊髓壓縮、糖尿病神經(jīng)病變、實驗性自身免疫性腦脊髓炎有神經(jīng)保護作用［24］。

德國的小樣本量的成人中腦動脈中風后應用大劑量rhEPO治療臨床試驗樣本例數(shù)及范圍有限，CEPO作為新的EPO結(jié)構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)改變后神經(jīng)保護效果與rhEPO之間是否存在差異，機制尚未明確。

故在本研究中，通過不同濃度rhEPO預處理后對試驗組內(nèi)皮細胞eNOS蛋白表達是否影響，明確EPO是否可降低凋亡蛋白Caspase?3合成，增加eNOS蛋白表達從而達到保護作用。實驗結(jié)果顯示，不同試驗組間細胞存活數(shù)量、Caspase?3、eNOS的變化，可知rhEPO預處理可提高缺血再灌注損傷下內(nèi)皮細胞的存活率，而且其保護作用隨rhE?PO濃度改變而變化，結(jié)合NO和EPO的激活作用機制和Lipton等提出的NO氧化還原狀態(tài)的不同作用，由此我們認為給予rhEPO預處理結(jié)合Epo?R致JAK2磷酸化直接激活PI3K/Akt通路而提高eNOS表達水平并延長其表達時間，通過以下途徑保護細胞：（1）由eNOS生成的NO氧化態(tài)NO+可以使?SH發(fā)生S-亞硝?；翹MDA受體通道活力下降，阻止Ca2+內(nèi)流以避免出現(xiàn)或減輕細胞鈣超載；（2）在體內(nèi)條件下可通過其產(chǎn)物NO氧化態(tài)NO+擴張腦組織內(nèi)豐富的側(cè)枝循環(huán)，改善局部腦血流，減少了iNOS的激活，降低缺血再灌注損傷誘導的氧化應激快速級聯(lián)反應的程度，提高血管內(nèi)皮細胞對缺血再灌注損傷的耐受力。

本研究完善rhEPO作用機制的研究，從不同途徑比較CEPO與rhEPO神經(jīng)保護效果。本實驗中體外缺血再灌注模型為成熟的模型，從MTT結(jié)果和蛋白印跡檢測結(jié)果可知，Caspase?3的誘導和細胞凋亡效果明確，所以未檢測cleaved?Caspase?3，除此之外，cleaved?Caspase?3由Caspase?3切割活化而來，兩者間的表達水平變化目前尚無固定比例。細胞免疫熒光檢測中由于進行固定、破膜、孵育、反復洗滌等步驟，檢測片子上所存留的細胞數(shù)量并不能代表真實的數(shù)量，但仍有一定的指導、參考作用，對EPO在預防神經(jīng)損傷方面的大范圍預防性應用具有重大意義。在下一步研究中，將研究并完善如何檢測cleaved?Caspase?3顯示凋亡程度，并進行分析。