miR-128通過RECK靶向作用影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

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(1.寶雞市人民醫(yī)院普外科,陜西 寶雞 721000;2.寶雞市中心醫(yī)院血液腫瘤科,陜西 寶雞 721000)

微小RNA(miRNA)是由約22個(gè)核苷酸組成的小非編碼RNA，負(fù)調(diào)節(jié)真核生物中的基因表達(dá)[1-3]。miRNA基因是哺乳動(dòng)物中最豐富的調(diào)控基因類型之一；越來越多的證據(jù)表明，miRNA是動(dòng)物發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，并參與人類疾病，如多種類型的惡性腫瘤[4-5]。miR-128在各種實(shí)體腫瘤中過表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌[6-7]。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-128的高表達(dá)水平與肺癌和胰腺腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)[8-10]。所有這些證據(jù)都以miR-128在人類癌癥中作為致癌miRNA(oncomiR)起作用。然而miR-128在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制在很大程度上是未知的。本研究旨在探討miR-128對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和裸鼠體內(nèi)成瘤行為的影響，驗(yàn)證RECK是否為miR-128的靶點(diǎn)，并探討miR-128在這個(gè)過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本和實(shí)驗(yàn)器材

2014年3月至2015年3月于寶雞市人民醫(yī)院收集60例組織標(biāo)本，其中包括乳腺癌癌組織和相鄰的正常組織，所有樣本均立即保存于液氮中。手術(shù)后，-80 ℃儲(chǔ)存直到RNA提取。所有組織診斷都具有病理和/或細(xì)胞學(xué)證據(jù)。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因，Trizol購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Kapa公司，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，熒光素酶報(bào)告載體由Promega公司合成，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Matrigel購(gòu)自Bio-Rad。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株和培養(yǎng)

人類乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)獲自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素或100 mg/mL鏈霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃的含5%CO2的恒溫孵箱中。

1.3 RNA分離和定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)分析

使用TRIzol試劑從組織或細(xì)胞中分離總RNA，并按照制造商的說明書用逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR的條件如下：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72℃ 15 s，然后40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)使用miR-128的特異性引物(正向引物5’TTTTCGAGGCGAGAAAATCG-3’以及反向引物5’ATGGAGGCTAGGGCGAAATC-3’)作為對(duì)照，用特異性引物(正向引物5’-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3’和反向引物5’-TGACGCTTGCCCACAGCCTT-3’)擴(kuò)增U6。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-128模擬物和相應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-NC)分別轉(zhuǎn)染到實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株中。按照生產(chǎn)商的說明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將模擬物或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行基因表達(dá)分析、細(xì)胞增殖、周期和侵襲測(cè)定。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告分析

RECK的野生型(Wt)和突變型(Mut)3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-UTR)由生物技術(shù)公司提供設(shè)計(jì)制備，并克隆到pMIR-Report質(zhì)粒中，稱為RECK-WT和RECK-Mut。對(duì)于熒光素酶測(cè)定，將1×105個(gè)細(xì)胞鋪板并在12孔板中培養(yǎng)以達(dá)到約70%匯合。細(xì)胞與miR-128模擬物或NC共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)RECK Wt/Mut報(bào)告質(zhì)粒的熒光表達(dá)活性。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：將不同組的2×107個(gè)乳腺癌細(xì)胞分別離心，用50 μL PBS稀釋重懸待用。10只4周左右的裸鼠，分為miR-128-siRNA組和NC組，每組5只，將2組乳腺癌細(xì)胞分別注射入左側(cè)腋下，2周后觀察腫瘤形成情況。6周后將腫瘤剝除，測(cè)量并稱重腫瘤。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-128在細(xì)胞株中的慢病毒轉(zhuǎn)染效率對(duì)RECK蛋白的影響

本研究通過qPCR分析來檢測(cè)miR-128的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，與NC組相比，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-128-siRNA之后的miR-128表達(dá)顯著更高。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RECK蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，抑制miR-128的表達(dá)后RECK蛋白表達(dá)水平相對(duì)下調(diào)[(8.36±1.11)vs.(2.09±0.86)，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

*:與NC組比較，P<0.05

圖1miR-128在細(xì)胞株中的慢病毒轉(zhuǎn)染效率對(duì)RECK蛋白的影響

2.2 miR-128與RECK在乳腺癌細(xì)胞中的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究miR-128在乳腺癌、TargetScan、Pictar-Vert和microRNA發(fā)展中的作用機(jī)制和致癌作用。在組合預(yù)測(cè)的3個(gè)軟件中，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RECK是miR-128的潛在靶標(biāo)。RECK 3’UTR與miR-128的結(jié)合位點(diǎn)相似(圖2a)，表明RECK可能是miR-128的直接靶標(biāo)。因此通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)了解miR-128和RECK之間的相互調(diào)控關(guān)系，我們構(gòu)建了含有與熒光素酶基因融合的野生型或突變型RECK的3’UTR的質(zhì)粒(圖2b)，將野生型或突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至具有miR-128m或miR-128m NC的293細(xì)胞中。miR-128顯著降低RECK的野生型3’UTR的熒光素酶活性，而RECK的突變型3’UTR的熒光素酶活性不被miR-128抑制，表明miR-128可以直接結(jié)合RECK的3’UTR。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RECK是乳腺癌細(xì)胞中miR-128的直接靶標(biāo)，并且mRNA降解涉及miR-128抑制RECK的表達(dá)。

2.3 miR-128對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外成瘤行為的影響

為了闡明表達(dá)miR-128對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)分析了其在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的變化。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-128的表達(dá)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤行為，腫瘤的體積和質(zhì)量都受到一定程度的抑制，提示miR-128可以直接抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)(圖3)。

a:miR-128與RECK的相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)；b：熒光素酶活性

圖3 miR-128對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外成瘤行為的影響

2.4 裸鼠體內(nèi)移植瘤中RECK蛋白的表達(dá)情況

如圖4所示，可見NC組圖RECK蛋白的表達(dá)陽性率明顯升高，與NC組相比，細(xì)胞核中的染色比例明顯較處理過的乳腺癌細(xì)胞在裸鼠內(nèi)成瘤組織中RECK蛋白的表達(dá)水平相對(duì)減弱，用miR-128-siRNA轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的RECK蛋白表達(dá)陽性率，提示miR-128可能調(diào)控裸鼠體內(nèi)RECK蛋白的表達(dá)。

a:NC組；b:miR-128-siRNA組

3 討論

目前乳腺癌是全世界常見的女性惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家，乳腺癌是主要死因之一[11]。乳腺癌早期易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，晚期的治療手段有限，且治療效果通常不佳，因而提高乳腺癌患者的早期診斷率和治療效果尤為重要，關(guān)于乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程的機(jī)制探討及新型治療靶點(diǎn)的研究尤為關(guān)鍵。

miR-128能通過靶向腫瘤抑制因子TP53INP1和RhoA分別促進(jìn)胰腺腫瘤發(fā)展和乳腺上皮細(xì)胞遷移及侵襲[7-8]。另外，miR-128通過在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中靶向Ship和C/EBPβ誘導(dǎo)B細(xì)胞惡性腫瘤[9-10]。鑒于miRNA通常調(diào)控大量目標(biāo)，推測(cè)可能有更多miR-128靶標(biāo)參與腫瘤發(fā)生[11]。盡管已發(fā)現(xiàn)miR-128在乳腺癌中上調(diào)，但其在乳腺腫瘤發(fā)生中的作用尚未確定。研究miR-128在乳腺癌中的表達(dá)情況及相關(guān)作用機(jī)制，可以為乳腺癌的臨床侵襲發(fā)展等情況提供一定的理論參考。

miR-128基因座位于被稱為B細(xì)胞整合簇的區(qū)域內(nèi)，最初被認(rèn)為是與淋巴瘤相關(guān)的原癌基因[12]。在B細(xì)胞淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病中BIC/miR-128表達(dá)上調(diào)，miR-128首先涉及造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生[13-14]。此外，本研究顯示，miR-128的表達(dá)下調(diào)可以顯著抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與Ji等[15]探討的使用miR-128抑制劑阻斷miR-128抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。但是，miR-128如何在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，從而解釋miR-128對(duì)MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目前尚未見相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究miR-128在乳腺癌細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)，TargetScan、Pictar-Vert和microRNA軟件組合預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)RECK是一個(gè)潛在的miR-128的靶標(biāo)。因此，我們將注意力集中在RECK的表達(dá)效果上。p53主要通過轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)參與多個(gè)過程(包括細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和細(xì)胞凋亡)的靶基因發(fā)揮其腫瘤抑制功能[16]。RECK也是p53的靶基因之一，是位于染色體8q22上的p53誘導(dǎo)型細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)基因[17]。其表達(dá)依賴于廣泛型p53的激活[18]。最初，RECK表達(dá)可以直接誘導(dǎo)小鼠急性胰腺炎的體內(nèi)發(fā)展。腫瘤抑制基因RECK的過度表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，并增強(qiáng)p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們還發(fā)現(xiàn)RECK的異位表達(dá)通過抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。Walsh等[20]對(duì)RECK的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，在81例乳腺癌中，與正常乳腺組織相比，45例(55.6%)RECK的表達(dá)降低。RECK的表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和p53異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[20]。此外，有報(bào)道顯示RECK的陽性率隨著胃癌的進(jìn)展而下降，RECK蛋白陰性與胃癌的侵襲性病理表型顯著相關(guān)[21-23]。這些觀察結(jié)果表明RECK通過其抗增殖和促凋亡活性在抑制包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-128的過表達(dá)不僅導(dǎo)致RECK的下調(diào)，在裸鼠體內(nèi)RECK蛋白的表達(dá)也受miR-128的調(diào)控，提示miR-128顯著降低了RECK 3’UTR的相對(duì)熒光素酶活性，進(jìn)一步支持了兩者相互調(diào)控的關(guān)系。

綜上所述，miR-128在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，miR-128表達(dá)的上調(diào)可以進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，并且提示miR-128和RECK可能成為乳腺癌的潛在治療靶標(biāo)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬研究miR-128調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系及對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，完善相關(guān)研究機(jī)制。