平菇栽培及平菇中酪氨酸酶活力抑制的動(dòng)力學(xué)研究

陳駿穎　馮學(xué)軍　羅子皓　吳江維　焦元紅　楊裕啟

摘 要 本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)平菇進(jìn)行栽培，中期對(duì)平菇中酪氨酸酶提取和純化，后期對(duì)得到的氨酸酶進(jìn)行活性抑制的動(dòng)力學(xué)研究。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不同pH、溫度、抑制劑下酶活力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： pH值為6.8，溫度為30℃時(shí)，平菇中酪氨酸酶催化活力最大，其中0.3mmol/L的L-半胱氨酸對(duì)酪氨酸酶有較好的活力抑制作用，且L-半胱氨酸對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型為不可逆競(jìng)爭(zhēng)性。

關(guān)鍵詞 平菇 酪氨酸酶 褐變 催化活力 抑制作用 動(dòng)力學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

平菇是一種可食用的植物門(mén)側(cè)耳真菌。平菇栽培有著可觀(guān)的經(jīng)濟(jì)效益，但由于平菇組織細(xì)胞中含有大量水，平菇表面保水能力又較弱，室溫下采摘后若不經(jīng)過(guò)處理，平菇菇體1-2天便會(huì)大量失水，菌蓋收縮，菌體發(fā)生明顯褐變。催化平菇發(fā)生褐變的酶是酪氨酸酶（PPO）。本此實(shí)驗(yàn)選用平菇作為PPO的來(lái)源，用鄰苯二酚做底物來(lái)研究酪氨酸酶在不同pH值、溫度時(shí)的表現(xiàn)出的催化活性情況，以及加入乙酸、檸檬酸、L-半胱氨酸、NaCl等不同的抑制劑的抑制效果，以及平菇中酪氨酸酶對(duì)L-半胱氨酸的抑制類(lèi)型，從而為平菇后期的處理和保存提供理論指導(dǎo)，具有積極的實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。

1主要儀器與藥品

立式壓力滅菌鍋（LDZX-50KAS）； UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津有限公司）；BS 224 S電子天平；（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； UB-7酸度計(jì)（北京丹佛儀器有限公司）； DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）； QY-1000A移液器（北京青云卓立精密儀器有限公司）；氯化鈉（AR.國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；L-半胱氨酸（AR.上海谷研生物科技有限公司）；鄰苯二酚；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；冰乙酸（AR.天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（AR.北京康普匯科技有限公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1栽培方法

首先制作培養(yǎng)基，然后裝袋，置于高壓蒸汽滅菌鍋中設(shè)置溫度為120℃、時(shí)間為120min。滅菌完成后，帶菌棒冷卻后將菌種均勻撒一薄層于培養(yǎng)基兩端，用白紙封口，置于培養(yǎng)房中定期澆水。

2.2 PPO粗酶液的提取

采用機(jī)械破碎法對(duì)蘑菇細(xì)胞進(jìn)行粉碎，采用冰丙酮法對(duì)酪氨酸酶進(jìn)行提取，蘑菇的質(zhì)量與冰丙酮的體積之比為1：2。得到濾餅，用冰丙酮反復(fù)沖洗，直到無(wú)色。濾液加入等體積飽和（NH4）2SO4低溫放置，待沉淀完全后進(jìn)行離心，0 ℃下， 10000 r·min-1離心 10min，收集沉淀物。得粗酶73.076g。

2.3粗酶液的純化

2.3.1 SePhadex G-100凝膠柱層析分離

首先從層析柱上端以一定速度通入磷酸緩沖液，當(dāng)下端流出液在分光光度計(jì)280nm處檢測(cè)下吸光值小于0.05時(shí)，平衡完成。開(kāi)始進(jìn)樣。待層析柱平衡完成后，將進(jìn)樣管接入樣品管中，上樣，其中應(yīng)控制進(jìn)樣速度與洗脫速度相當(dāng)，進(jìn)樣速度為6r/min。待樣品完全進(jìn)入后，進(jìn)樣管插入緩沖液中，進(jìn)行洗脫，同時(shí)記錄儀器上的吸光值，每5min記一次，流出液達(dá)到5mL時(shí)，換管。繼續(xù)洗脫并收集流出液，直至吸光值接近0為止。

2.3.2純化酶的收集

取微量鄰苯二酚溶于少量水中，取6只試管，將鄰苯二酚溶液均分至這6只試管內(nèi)，分別從對(duì)應(yīng)序號(hào)的試管內(nèi)吸取少量酶液，震蕩，放置10min，對(duì)比試管顏色變化。顏色較深，說(shuō)明酶量較多，顏色較淺，表明，幾乎不含PPO。將含有PPO的流出液分別倒在50mL的燒杯中，再倒入10mL的冰丙酮提取，放置冰箱冷卻，有PPO的絮凝產(chǎn)生，2h后，對(duì)絮凝后的PPO進(jìn)行離心，取沉淀物，再對(duì)沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥。

2.3.3 PPO活力的測(cè)定

首先配制0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液）和濃度為0.01mol/L鄰苯二酚溶液，再將1.910mg的純化后的酪氨酸酶溶于5mL緩沖液（pH=7.0）中。取3mL緩沖液（pH=6.8）加入比色皿中，再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內(nèi)每10s記錄一組吸光值A(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后作吸光值 A與反應(yīng)時(shí)間t的關(guān)系曲線(xiàn)圖，由曲線(xiàn)最初直線(xiàn)段的斜率（ A/t）計(jì)算PPO活力。

2.3.4 pH對(duì)酶活力的測(cè)定

配制pH值為4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽緩沖液，在比色皿中分別加入3mL上面所配制的緩沖液，再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內(nèi)每10s記錄一組吸光值A(chǔ)。由曲線(xiàn)最初直線(xiàn)段的斜率（ A/t）計(jì)算PPO活力。

2.3.5溫度對(duì)酶活力的測(cè)定

在比色皿中加入3mL的緩沖液（pH=6.8），用水浴鍋對(duì)鄰苯二酚溶液進(jìn)行加熱，溫度梯度為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60，在相應(yīng)溫度下保溫3min。再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，換掉槍頭后，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內(nèi)每10s記錄一組吸光值A(chǔ)。由曲線(xiàn)最初直線(xiàn)段的斜率（ A/t）計(jì)算PPO活力。

2.3.6抑制劑對(duì)酶活力的測(cè)定

用3mL，pH=6.8的緩沖溶液配制濃度如表 1所示的乙酸、檸檬酸、L-半胱氨酸、NaCl溶液，采用如上方法。3min內(nèi)每10s記錄一組吸光值A(chǔ)。由曲線(xiàn)最初直線(xiàn)段的斜率（ A/t）計(jì)算PPO活力。計(jì)算PPO在不同濃度值下的相對(duì)酶活，并計(jì)算抑制率。

3結(jié)果與討論

3.1平菇的栽培

在后期的栽培過(guò)程中，有個(gè)別菌棒產(chǎn)生霉菌，致使該菌棒的生長(zhǎng)受到影響，其他菌棒生長(zhǎng)情況良好， 28天左右，整個(gè)菌棒長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲，菌棒呈現(xiàn)白色，變輕，之后3天，菌棒兩端開(kāi)始長(zhǎng)出幼小的子實(shí)體，隨后3天，平菇成熟，可以開(kāi)始采摘。

3.2平菇中PPO的提取和純化

對(duì)沉淀物冷凍干燥后沉重，提取純酶1.910mg，純化收率為2.6%，純化率在正常范圍內(nèi)。由于酶在生物體內(nèi)的存在是微量的，平菇中PPO的活性在低溫下受到很好的抑制，因此冷凍過(guò)會(huì)進(jìn)行研磨，能有效的控制平菇發(fā)生褐變，還抑制了PPO被分解。

3.3 PPO的活性抑制的動(dòng)力學(xué)研究

3.3.1 pH對(duì)PPO酶活力的影響

不同pH對(duì)PPO酶活力的影響如所示，PPO的相對(duì)酶活受pH值的影響較為明顯，pH=6.8時(shí)達(dá)到最大酶活。在測(cè)定的pH值在4.0～8.0之間時(shí)，PPO的活性有一個(gè)先增強(qiáng)后減弱的過(guò)程，由此，在平菇的后期處理加工過(guò)程中，應(yīng)盡量避免pH值接近6.8，而應(yīng)該選擇一個(gè)pH值大于8.0的環(huán)境進(jìn)行儲(chǔ)藏和加工。這樣能有效抑制PPO酶的活性。

3.3.2溫度對(duì)酶活力的影響

不同溫度對(duì)PPO酶活力影響如圖，PPO的相對(duì)酶活受溫度影響呈一個(gè)波動(dòng)的狀態(tài)，但在局部范圍內(nèi)影響較為明顯，在溫度左接近30℃時(shí)其相對(duì)酶活達(dá)到最高峰值。有圖可知，在15～60℃之間，PPO的活性先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)溫度在20℃以下或50℃以上時(shí)，活性較弱。主要原因是溫度較低時(shí)，酶促反應(yīng)所需要的能量達(dá)不到，而溫度過(guò)高時(shí)，由于PPO是一種蛋白質(zhì)，其過(guò)熱變形失活，也使反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行。由此可見(jiàn)，在在平菇的后期處理加工過(guò)程中，可利用低溫抑制和相對(duì)高溫失活的方法延緩褐變現(xiàn)象的發(fā)生。

3.3.3抑制劑對(duì)酶活力的影響

不同抑制劑對(duì)平菇PPO活力影響也不同，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，L-半胱氨酸在低濃度時(shí)對(duì)平菇PPO的活性就表現(xiàn)出很強(qiáng)烈的抑制作用，在濃度為0.3mmol/L時(shí)就完全抑制了PPO的活性；乙酸對(duì)比其他兩種抑制劑而言，其抑制作用也較強(qiáng)烈，乙酸濃度為0.20%即可達(dá)到84.3%的抑制率；檸檬酸和氯化鈉同前兩種對(duì)比，抑制作用不明顯。

基金項(xiàng)目：大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：17cx15）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練（項(xiàng)目編號(hào)：201710920029）。

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