對市郊家養(yǎng)奶牛的鮮牛乳及自制酸乳和冰淇淋中金黃色葡萄球菌含量的檢測與評估

靳志敏 王燕 王茹 鄭玉山 張宏博

摘 要：本文通過對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的家養(yǎng)獨(dú)立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌的含量進(jìn)行檢測，判斷其制品的質(zhì)量是否合格。檢測結(jié)果顯示，呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的獨(dú)立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳及自制酸乳、冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌數(shù)量為0cfu/g，品質(zhì)合格。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌 革蘭氏染色實(shí)驗(yàn) 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

1 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類細(xì)菌性食物中毒及奶牛乳房炎癥的重要細(xì)菌之一[1]。在顯微鏡下，金黃色葡萄球菌呈球狀，直徑約0.8μm，其細(xì)胞既沒有芽孢也沒有鞭毛，但少部分會(huì)有莢膜；在平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1～2mm。金黃色葡萄球菌的生長條件簡單，可在沒有水的條件下存活幾周，屬于需氧或兼性厭氧微生物，其在普通培養(yǎng)基上就可以生長，最適宜生長的pH值為7.4；最適生長溫度為37℃，溫度過高會(huì)使金黃色葡萄球菌死亡[2]。

金黃色葡萄球菌容易引發(fā)大規(guī)模食物中毒，在造成經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的社會(huì)影響[3]。在乳及乳制品中，可能由于奶?；加腥榉垦装Y等原因而易發(fā)生金黃色葡萄球菌污染現(xiàn)象。所以本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的家養(yǎng)獨(dú)立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌的含量進(jìn)行檢測，判斷其制品的質(zhì)量是否合格。

2 材料與方法

2.1 樣品

樣品包括現(xiàn)擠生鮮牛乳（散裝）、自制酸乳、自制冰淇淋3類，均來自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特周邊旗縣村散養(yǎng)養(yǎng)殖戶家中，共計(jì)20戶，地區(qū)分布如圖1。樣品冷凍或冷藏保存，且在8小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)選擇樣品作為實(shí)驗(yàn)組，將1mL金黃色葡萄球菌原液加入到25mL無菌水作為陽性對照組，無菌水為陰性對照組。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 檢測方法

參考《國標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌》GB 4789.10-2016對樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測。牛乳、自制酸奶各取25mL，冰淇淋雪糕則用電子天平取25g，將樣品放入裝有225mL 0.85%的氯化鈉溶液均質(zhì)袋中，均質(zhì)1分鐘后得到1：10的均勻樣液。用移液器吸取制好的均勻樣液1mL，加入至9mL氯化鈉溶液的鹽水管中，充分震蕩，或用移液槍反復(fù)吸取，使其充分混勻后制成-2級樣品勻液；重復(fù)上述步驟，將樣品稀釋到-4、-5、-6、-7級（每次吸取完上一級樣品勻液后需更換移液器的槍頭以防止梯度不準(zhǔn)）。將稀釋好的每一個(gè)梯度樣品勻液吸取1mL，加入到接種量分別為0.3mL、0.3mL和0.4mL的B-P（Baird-Parker）平板中，加入后用無菌涂布棒涂布整個(gè)B-P板，涂布過程需防止將培養(yǎng)基刮破，注意不要碰到培養(yǎng)基邊緣[4]。涂布過程中B-P板最好有一定余溫，這樣可以使樣液被平板更好吸收。當(dāng)B-P平板表面沒有明顯樣液時(shí)，涂布完成；將平板靜置10分鐘后，倒置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后取出觀察是否有菌落生長。若有數(shù)據(jù)，需保存好數(shù)據(jù)并準(zhǔn)備滅菌殺毒；若沒有，可直接放入生物垃圾袋等待滅菌殺毒。

2.2.2 驗(yàn)證方法

在觀察過程中若有典型的金黃色葡萄球菌落生成則要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

①革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)：利用已經(jīng)制好的結(jié)晶紫溶液、革蘭氏碘液以及沙黃對在B-P板上長出的典型菌落進(jìn)行染色。首先將典型的菌落制成涂片放到顯微鏡上，滴幾滴結(jié)晶紫溶液，一分鐘后用水洗掉；然后滴加革蘭氏碘液，讓其在涂片上停留作用一分鐘后水洗[5]；接著用乙醇進(jìn)行褪色處理，一般30秒即可，直到完全洗掉，但不能太過脫色，之后用水清洗；最后，滴加上沙黃復(fù)染液，約一分鐘后水洗，晾干后進(jìn)行鏡檢[6]。

②血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)：將每個(gè)長菌B-P平板上典型的金黃色葡萄球菌菌落都接到BHI與營養(yǎng)瓊脂的小斜面試管中，在37℃下培養(yǎng)18h。將凍干兔血漿加水溶解后，向瓶中加入0.3mL培養(yǎng)過的BHI（腦心浸出液肉湯），充分震蕩，放在36℃下培養(yǎng)，每隔半個(gè)小時(shí)觀察一次，并持續(xù)觀察6個(gè)小時(shí)，如果有凝固或者凝固的體積比原來的體積大一半，則可以判斷為陽性的結(jié)果，菌落為金黃色葡萄球菌[7]。

若對結(jié)果還存有疑慮，可挑選經(jīng)過小斜面培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌落于BHI中，在37℃下培養(yǎng)18h，再次重復(fù)上述過程。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組中生鮮牛乳在36℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，結(jié)果如表1所示（因?yàn)闃悠穼?shí)驗(yàn)后結(jié)果完全相同，故只取其中5組數(shù)據(jù)舉例分析，下同），菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖2可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質(zhì)合格。

實(shí)驗(yàn)組中，自制酸奶在36℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，結(jié)果如表2所示，菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖3可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質(zhì)合格。

實(shí)驗(yàn)組中，冰淇淋雪糕于36℃下培養(yǎng)48小時(shí)后，結(jié)果如表3所示，菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖4可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測樣品的品質(zhì)均合格。

陽性對照組實(shí)驗(yàn)中，B-P板上有菌落生長如圖5所示，結(jié)果如表4。經(jīng)計(jì)算，金黃色葡萄球菌數(shù)量為4.9×108cfu/g。

陰性對照組中，由圖6可以看出B-P平板沒有金黃色葡萄球菌菌落生成，結(jié)果如表5，證明實(shí)驗(yàn)沒有被污染，實(shí)驗(yàn)成功。

3.2驗(yàn)證結(jié)果

對陽性對照組B-P板上的菌落進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，染色實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象如圖7所示，排列呈葡萄球狀、無芽胞、無莢膜、直徑約為0.5～1μm。驗(yàn)證該微生物為金黃色葡萄球菌，驗(yàn)證成功。

將B-P板上生長出的黑色小點(diǎn)沾取一點(diǎn)，然后在營養(yǎng)瓊脂小斜面輕輕上劃線，培養(yǎng)后均如圖8所示，圖中透明無色的部分為生長出的菌落，驗(yàn)證成功，黑色小點(diǎn)是一種微生物菌落。

將B-P板上長出的菌加入到BHI培養(yǎng)液做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，本次血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)均用凍干兔血漿，加500mL無菌水溶解后加入0.3mL的BHI培養(yǎng)液，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，圖中左側(cè)為金黃色葡萄球菌陽性菌，右側(cè)為陰性對照實(shí)驗(yàn)，左側(cè)瓶中出現(xiàn)凝固，結(jié)果為陽性，表明該微生物為金黃色葡萄球菌。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的家養(yǎng)獨(dú)立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，3種自制產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)為0cfu/g，表明產(chǎn)品中均不含有金黃色葡萄球菌，品質(zhì)合格。

本次實(shí)驗(yàn)對呼和浩特市市郊20戶散養(yǎng)養(yǎng)殖戶的生鮮牛乳及乳制品的檢測中未發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，說明呼市散養(yǎng)養(yǎng)殖戶家生產(chǎn)的生鮮牛乳及乳制品符合食品安全規(guī)范。但是由于樣本量較少，仍不足以說明全部地區(qū)都符合安全標(biāo)準(zhǔn)。對于金黃色葡萄球菌的檢測是必不可少的，企業(yè)和監(jiān)管部門一定要足夠重視食品安全，并時(shí)刻關(guān)注金黃色葡萄球菌的檢測發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳丙卿，王茂起.現(xiàn)代食品衛(wèi)生學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001，757-758.

[2] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001，246-247.

[3] Post. D.E Food pathogens（Staphylococcus aureus）[J]. Monograph number 6. England.

[4] 張穎.金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)物保健，2014，（6）：17-19.

[5] 謝范英.食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法比較研究[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2014，（17）：197-198.

[6] 黃嶺芳，賴衛(wèi)華，張莉莉.食品中金黃色葡萄球菌快速檢測方法的研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2009，（6）：181-185.

[7] GB 4789.10-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)[S].