響應面法優(yōu)化黑豆蛋白提取工藝及功能性測定

富天昕，王長遠，馮玉超，李雪

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

黑豆又稱冬子豆、櫓豆，外形似卵圓或球形，顏色為深綠或者黑色，我國東北地區(qū)出產最多[1]。黑豆素有“植物蛋白之王”的稱號，它的蛋白質含量可達到36%～40%，遠超雞蛋和牛奶等食品[2]。黑豆蛋白必需氨基酸組成種類齊全且比例適合，是一種完全蛋白質[3]，有助于人體吸收。黑豆也是一種特殊的功能性食品，有醫(yī)食同療的作用，具有一定的抗衰老的功效[4]。隨著黑豆營養(yǎng)價值和藥用價值不斷被開發(fā)利用，人們對黑豆產品的需求也迅速增加，提高了黑豆的使用價值。黑豆蛋白的提取能夠有效改善植物蛋白資源缺乏和來源單一的問題，提高了黑豆的利用價值。

堿溶酸沉法具有成本低、操作簡便等特點[5]，是目前提取黑豆蛋白最主要的方法。試驗以黑豆蛋白提取率為指標，采用堿溶酸沉的方法，應用單因素試驗和響應面設計法分析不同因素對黑豆蛋白提取率的影響，優(yōu)化黑豆蛋白提取條件。研究采用堿溶酸沉法提取出的黑豆蛋白，對其溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、持水性及持油性進行測定，為高效提取黑豆蛋白及其加工與利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料試劑

黑豆：市售；濃硫酸、碳酸鈉、福林酚試劑甲、硫酸銅、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、正己烷、鹽酸、福林酚試劑乙、酒石酸鉀鈉、十二烷基硫酸鈉、牛血清蛋白、氯化鈉（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器設備

RH-600A型高速多功能粉碎機：浙江榮浩工貿有限公司；DGG-9150G鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；RE-2000B型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；RSJ200-4型電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；TD5A型臺式低速離心機：長沙英泰儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器：江蘇省金壇市宏華儀器廠；79-1型磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市虹盛儀器廠；補充型號冷凍干燥機：上海歆睿生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑豆原料成分分析

水分的測定：GB5009.3－2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》進行測定；脂肪的測定：GB5009.6－2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》進行測定；蛋白的測定：GB5009.5－2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》標準方法進行；灰分測定：GB5009.4－2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

1.2.2 提取黑豆蛋白工藝流程

黑豆→清理→粉碎→過篩→脫脂→堿溶→水浴加熱→離心取上清液（4 000 r/min，5 min）→酸沉→靜放1 h→離心取沉淀（4 000 r/min，15 min）→將蛋白置于-80℃冷凍→冷凍干燥→黑豆蛋白。

1.2.3 黑豆蛋白提取率

提取率計算公式如下：

式中：M1為提取出黑豆蛋白的質，g；M2為原料脫脂黑豆粉的質量，g；C為固定脫脂黑豆中蛋白質的百分比，%。

1.2.4 提取黑豆蛋白單因素試驗

以黑豆蛋白提取率為評價指標，探究不同pH值、液料比、提取溫度、提取時間對黑豆蛋白提取率的影響。

1.2.5 提取黑豆蛋白響應面試驗

在單因素研究的基礎上，確定各因素的水平值范圍，采用響應面中心組合試驗設計，選取混合液pH值、液料比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量，以黑豆蛋白提取率為響應值，優(yōu)化提取黑豆蛋白工藝的最佳參數(shù)。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.6 提取黑豆蛋白功能性測定

1.2.6.1 溶解性測定

根據(jù)氮溶解指數(shù)（nitrogen soluble index，NSI）法加以改進，準確取黑豆蛋白粉0.5 g溶于20 mL樣品緩沖液里，用1 mol/L氫氧化鈉或1 moI/L鹽酸溶液各調節(jié)pH 值至 2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，經過 45 min 的磁力攪拌，接著在離心機中3 000 r/min進行30 min，測定上清液里的蛋白百分數(shù)采納Foline phenol法，并制作NSI-pH曲線[6]。

1.2.6.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

稱取黑豆蛋白2.0 g放在帶刻度的離心管里，添加100 mL水，用1 mol/L HCl或1 moI/L NaOH溶液分別調 pH 值至 3.0、5.0、7.0、9.0。磁力攪拌 1 h，在離心機中于4 000 r/min條件下進行20 min，添加25 mL大豆色拉油，液油比為4∶1（體積比），接著在9 500 r/min下高速攪拌2 min，馬上在溶液底層抽取50 μL。將抽取的溶液濃度用備好的0.1%十二烷基硫酸鈉溶液放大100倍，混合完馬上于500 nm波長下測定吸光值A0，以SDS液作對照組。放置于室溫下30 min，第二次取樣測量吸光值A1。乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）[7]。

式中：T為2.303；ρ為黑豆蛋白樣品質量濃度，g/mL；Φ為乳化液中油相的比例0.25；N為稀釋倍數(shù)；t是時間，min；A0為初次測量乳化液的吸光值；A1為30 min后的吸光值。

1.2.6.3 起泡性和起泡穩(wěn)定性測定

稱取2.0 g黑豆蛋白放在帶刻度離心管里，加入100 mL水，用1 mol/L氫氧化鈉或1 moI/L鹽酸溶液各調節(jié)pH值至3.0、5.0、7.0、9.0。磁力攪拌1 h后在離心機中以4 000 r/min離心20 min，然后以9 500 r/min高速攪拌2 min，測定攪拌截止時刻的起泡體積量V0，0.5小時后，第二次測定起泡體積量V1[8]。

1.2.6.4 持水性測定

稱取0.5 g樣品放與帶刻度的離心管中，添加5 mL去離子水與其混合，室溫環(huán)境下靜置30 min，3 800 r/min旋轉分離20 min，測定得到的前后水相體積相差量就是樣品吸水量。持水性是指單位樣品水的吸附量用（water holding capacity，WHC）表示[9]。

1.2.6.5 持油性測定

稱量0.5 g樣品放到帶刻度的離心管里，再添加5 mL油脂，拌勻，常溫下放0.5 h，3 800 r/min旋轉分離20 min，測定得到的前后油相體積相差量就是樣品吸油量。持油性（oil holding capacity，OHC）指單位樣品油的吸附量[9]。

2 結果與分析

2.1 黑豆主要成分

黑豆主要成分見表2所示。

表2 黑豆主要成分Table 2 The main components of soybean %

2.2 單因素條件對黑豆蛋白提取率的影響

2.2.1 pH值對黑豆蛋白提取率的影響

溫度為 50℃，液料比為 10∶1（mL/g），時間為 60min時，pH值對黑豆蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 pH值對黑豆蛋白提取率的影響Fig.1 pH on the effect of protein extraction

黑豆蛋白提取率先隨pH值的增大而增加，這是由于堿性條件能使蛋白分子結構變得疏松，堿液對蛋白有增溶的效果。當pH值為9時，提取率達到最大值，之后提取率呈下降勢，可能是由于溶液堿性過大會導致蛋白質中的氫鍵發(fā)生斷裂，使蛋白質變性[10]。

2.2.2 液料比對黑豆蛋白提取率的影響

液料比對黑豆蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 液料比對黑豆蛋白提取率的影響Fig.2 Liquid－solid ratio on the effect of protein extraction

由圖2可知，當溫度為50℃，pH值為8，時間為60 min時，整體呈先上升后下降的趨勢，當液料比為12∶1（mL/g）時，提取率達到最大值。液料比較低的條件下，蛋白的提取率也較低，其原因是溶液較少，體系分散不均，使得蛋白質無法充分溶解[11]。

2.2.3 溫度對黑豆蛋白提取率的影響

當 pH 值為 8，時間為 60 min，液料比 10 ∶1（mL/g）時，溫度對黑豆蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 溫度對黑豆蛋白提取率的影響Fig.3 Temperature on the effect of protein extraction

由圖3可知，隨著溫度的升高，提取率呈先上升后下降的趨勢，當溫度為50℃時，提取率達到最大值為46.8%，之后提取率下降，原因在于溫度過高會導致蛋白質的變性[12]，從而影響蛋白質的提取。

2.2.4 時間對黑豆蛋白提取率的影響

時間對黑豆蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 時間對黑豆蛋白提取率的影響Fig.4 Time on the effect of protein extraction

由圖4可知，在溫度為50℃，pH值為8，液料比10∶1（mL/g）的條件下，隨著黑豆浸提時間延長，蛋白的溶出率越高，當浸提時間為50 min時，提取效果最好。當浸提時間超過50 min時，蛋白質提取率開始下降，說明浸提時間過長會破壞蛋白質的結構，從而使蛋白提取率下降。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應試驗安排及結果

試驗應用響應面優(yōu)化法進行過程優(yōu)化。以X1pH值、X2液料比（mL/g）、X3提取溫度（℃）、X4提取時間（min）為自變量，以分離蛋白提取率為響應值Y，響應面試驗方案及結果見表3。

2.3.2 對黑豆蛋白提取率的響應面結果分析

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應面回歸模型如下：Y=50.29+0.38X1+0.038 0X2+0.55X3+0.81X4-0.25X1X2+0.048X1X3+0.036X1X4+0.39X2X3+0.50X2X4-0.077X3X4-1.85X12-1.57X22-2.14X32-1.62X42?；貧w分析與方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗方案及試驗結果Table 3 Design and result of response surface analysis

表4 回歸與方差分析結果Table 4 Results of regression and variance analysis

續(xù)表4 回歸與方差分析結果Continue table 4 Results of regression and variance analysis

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，并且該模型R2=97.28%，R2Adj=94.74%，說明該模型與試驗擬合良好。自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，當pH值為9，液料比為12∶1（mL/g），溫度 51℃，時間 53 min時，響應面最優(yōu)值為（50.45±0.32）%。響應面圖見5～圖8。

圖5 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

從圖5、圖6、圖7、圖8可以看出提取溫度、提取時間對提取效率影響顯著。在因素水平范圍，開始時提取率隨液料比的增大逐漸增大，達到最大理論之后緩慢減小。

2.3.3 驗證試驗

根據(jù)響應面得到的最優(yōu)值，即pH值為9，液料比為 12∶1（mL/g），溫度 52℃，時間 53 min的條件下，試驗進行了3次平行試驗，結果3次試驗平均值即黑豆蛋白平均提取率為50.21%，與響應面分析得到的黑豆蛋白提取的理想值（50.45±0.32）%很接近，說明試驗效果較好。

圖6 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的等高線圖Fig.6 Contour plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

圖7 液料比和時間對黑豆蛋白提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot of combined effects of liquid-soild ratio and time on black bean protein extraction

圖8 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的等高線圖Fig.8 Contour plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

2.4 黑豆蛋白功能性質的測定

2.4.1 溶解性

黑豆蛋白溶解性的測定結果見圖9。

圖9 黑豆蛋白溶解性的測定Fig.9 Determination of black bean protein solubility

在強酸環(huán)境下，蛋白分子多數(shù)是作為正極粒子，產生相斥作用，分散性良好，會使溶解性增加；在堿性環(huán)境下，蛋白質結構變得比較疏松，表面蛋白質分子帶一樣電荷，促進蛋白質與結合物分離，使黑豆蛋白質的溶解性提高[13]。因黑豆蛋白等電點pH值在4.5左右，在這個pH值環(huán)境下，阻礙了蛋白質多肽鏈之間靜電彼此排斥作用，進而打亂了蛋白質空間結構，使其溶解性降低。

2.4.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性

黑豆蛋白乳化性，乳化穩(wěn)定性的測定結果見圖10。

圖10 黑豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定Fig.10 Determination of emulsifying and emulsifying stability of black bean protein

黑豆蛋白乳化性隨著pH值的增大而增大。乳化性的持續(xù)增漲可能是由于蛋白質內部的疏水基團隨著pH值的增大而暴露的更充分，增加了油水界面的吸附量，使界面張力減小，從而提高了乳化性[14]。乳化穩(wěn)定性則是隨著pH值的升高而升高，當pH值為7時達到最高點，隨后減小。原因是在pH值小于7時，還沒有形成飽滿的界面使油滴穩(wěn)定，故在這個過程中吸附了大量微小的蛋白質顆粒，增加了乳化穩(wěn)定性[15]。

2.4.3 起泡性和起泡穩(wěn)定性

黑豆蛋白起泡性、起泡穩(wěn)定性的測定結果見圖11。

蛋白質當pH值是5時，起泡性處于最大，但隨pH值的變大，起泡性反而呈下降趨勢。起泡穩(wěn)定性是當pH值處于7時曲線到達最頂點，于酸性范疇pH值的變大，起泡穩(wěn)定性也相對的升高。但堿性范疇下跟隨pH值的變大，起泡穩(wěn)定性稍微下降。有相關研究表示，沒有溶解的蛋白質粒子可以提升起泡穩(wěn)定性[16]。其次較大分子量的蛋白具有穩(wěn)定的膜結構，也可提升起泡穩(wěn)定性[17]。

圖11 黑豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定Fig.11 Determination of foamability and foam stability of black bean protein

2.4.4 持水性

蛋白質的持水性是指在食品加工過程中蛋白質中的水分以及添加到蛋白質中水分的保持能力，與食品的質構有密切關系[18]。按照上述2.3.4.4的步驟進行試驗，并測得黑豆蛋白質的持水性為WHC（mL/g）=2.10。

2.4.5 持油性

蛋白質的持油性表示蛋白制品吸附油的性能[19]。按照上述2.3.4.5的步驟開展試驗，并測得黑豆蛋白質的持油性為 OHC（mL/g）=3.15。

3 結論

試驗利用響應面分析方法優(yōu)化了黑豆蛋白的提取工藝，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)：液料比為 12∶1（mL/g）、pH值為9、提取溫度為51℃、浸提時間為53 min。此時黑豆蛋白提取率可達50.45%。試驗對提取的黑豆蛋白功能特性進行了測定，結果表明黑豆蛋白的溶解性最高為57.33%；乳化性最大為17.22 m2/g；乳化穩(wěn)定性最佳為120.17 min；起泡性最好為39.66%；起泡穩(wěn)定性最優(yōu)為65.33%；持水性為2.10 mL/g；持油性為3.15 mL/g。說明采用堿溶酸沉法提取的黑豆蛋白具有良好的功能特性，可用于日后進一步的食品加工。此試驗為黑豆蛋白在食品工業(yè)中的應用提供了一定的借鑒意義。