響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆蛋白提取工藝及功能性測定

富天昕，王長遠，馮玉超，李雪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

黑豆又稱冬子豆、櫓豆，外形似卵圓或球形，顏色為深綠或者黑色，我國東北地區(qū)出產(chǎn)最多[1]。黑豆素有“植物蛋白之王”的稱號，它的蛋白質(zhì)含量可達到36%～40%，遠超雞蛋和牛奶等食品[2]。黑豆蛋白必需氨基酸組成種類齊全且比例適合，是一種完全蛋白質(zhì)[3]，有助于人體吸收。黑豆也是一種特殊的功能性食品，有醫(yī)食同療的作用，具有一定的抗衰老的功效[4]。隨著黑豆營養(yǎng)價值和藥用價值不斷被開發(fā)利用，人們對黑豆產(chǎn)品的需求也迅速增加，提高了黑豆的使用價值。黑豆蛋白的提取能夠有效改善植物蛋白資源缺乏和來源單一的問題，提高了黑豆的利用價值。

堿溶酸沉法具有成本低、操作簡便等特點[5]，是目前提取黑豆蛋白最主要的方法。試驗以黑豆蛋白提取率為指標，采用堿溶酸沉的方法，應(yīng)用單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計法分析不同因素對黑豆蛋白提取率的影響，優(yōu)化黑豆蛋白提取條件。研究采用堿溶酸沉法提取出的黑豆蛋白，對其溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、持水性及持油性進行測定，為高效提取黑豆蛋白及其加工與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料試劑

黑豆：市售；濃硫酸、碳酸鈉、福林酚試劑甲、硫酸銅、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、正己烷、鹽酸、福林酚試劑乙、酒石酸鉀鈉、十二烷基硫酸鈉、牛血清蛋白、氯化鈉（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

RH-600A型高速多功能粉碎機：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；DGG-9150G鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；RSJ200-4型電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；TD5A型臺式低速離心機：長沙英泰儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器：江蘇省金壇市宏華儀器廠；79-1型磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市虹盛儀器廠；補充型號冷凍干燥機：上海歆睿生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑豆原料成分分析

水分的測定：GB5009.3－2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》進行測定；脂肪的測定：GB5009.6－2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》進行測定；蛋白的測定：GB5009.5－2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》標準方法進行；灰分測定：GB5009.4－2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》。

1.2.2 提取黑豆蛋白工藝流程

黑豆→清理→粉碎→過篩→脫脂→堿溶→水浴加熱→離心取上清液（4 000 r/min，5 min）→酸沉→靜放1 h→離心取沉淀（4 000 r/min，15 min）→將蛋白置于-80℃冷凍→冷凍干燥→黑豆蛋白。

1.2.3 黑豆蛋白提取率

提取率計算公式如下：

式中：M1為提取出黑豆蛋白的質(zhì)，g；M2為原料脫脂黑豆粉的質(zhì)量，g；C為固定脫脂黑豆中蛋白質(zhì)的百分比，%。

1.2.4 提取黑豆蛋白單因素試驗

以黑豆蛋白提取率為評價指標，探究不同pH值、液料比、提取溫度、提取時間對黑豆蛋白提取率的影響。

1.2.5 提取黑豆蛋白響應(yīng)面試驗

在單因素研究的基礎(chǔ)上，確定各因素的水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計，選取混合液pH值、液料比、提取溫度、提取時間4個因素為自變量，以黑豆蛋白提取率為響應(yīng)值，優(yōu)化提取黑豆蛋白工藝的最佳參數(shù)。其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.6 提取黑豆蛋白功能性測定

1.2.6.1 溶解性測定

根據(jù)氮溶解指數(shù)（nitrogen soluble index，NSI）法加以改進，準確取黑豆蛋白粉0.5 g溶于20 mL樣品緩沖液里，用1 mol/L氫氧化鈉或1 moI/L鹽酸溶液各調(diào)節(jié)pH 值至 2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，經(jīng)過 45 min 的磁力攪拌，接著在離心機中3 000 r/min進行30 min，測定上清液里的蛋白百分數(shù)采納Foline phenol法，并制作NSI-pH曲線[6]。

1.2.6.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

稱取黑豆蛋白2.0 g放在帶刻度的離心管里，添加100 mL水，用1 mol/L HCl或1 moI/L NaOH溶液分別調(diào) pH 值至 3.0、5.0、7.0、9.0。磁力攪拌 1 h，在離心機中于4 000 r/min條件下進行20 min，添加25 mL大豆色拉油，液油比為4∶1（體積比），接著在9 500 r/min下高速攪拌2 min，馬上在溶液底層抽取50 μL。將抽取的溶液濃度用備好的0.1%十二烷基硫酸鈉溶液放大100倍，混合完馬上于500 nm波長下測定吸光值A(chǔ)0，以SDS液作對照組。放置于室溫下30 min，第二次取樣測量吸光值A(chǔ)1。乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）[7]。

式中：T為2.303；ρ為黑豆蛋白樣品質(zhì)量濃度，g/mL；Φ為乳化液中油相的比例0.25；N為稀釋倍數(shù)；t是時間，min；A0為初次測量乳化液的吸光值；A1為30 min后的吸光值。

1.2.6.3 起泡性和起泡穩(wěn)定性測定

稱取2.0 g黑豆蛋白放在帶刻度離心管里，加入100 mL水，用1 mol/L氫氧化鈉或1 moI/L鹽酸溶液各調(diào)節(jié)pH值至3.0、5.0、7.0、9.0。磁力攪拌1 h后在離心機中以4 000 r/min離心20 min，然后以9 500 r/min高速攪拌2 min，測定攪拌截止時刻的起泡體積量V0，0.5小時后，第二次測定起泡體積量V1[8]。

1.2.6.4 持水性測定

稱取0.5 g樣品放與帶刻度的離心管中，添加5 mL去離子水與其混合，室溫環(huán)境下靜置30 min，3 800 r/min旋轉(zhuǎn)分離20 min，測定得到的前后水相體積相差量就是樣品吸水量。持水性是指單位樣品水的吸附量用（water holding capacity，WHC）表示[9]。

1.2.6.5 持油性測定

稱量0.5 g樣品放到帶刻度的離心管里，再添加5 mL油脂，拌勻，常溫下放0.5 h，3 800 r/min旋轉(zhuǎn)分離20 min，測定得到的前后油相體積相差量就是樣品吸油量。持油性（oil holding capacity，OHC）指單位樣品油的吸附量[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆主要成分

黑豆主要成分見表2所示。

表2 黑豆主要成分Table 2 The main components of soybean %

2.2 單因素條件對黑豆蛋白提取率的影響

2.2.1 pH值對黑豆蛋白提取率的影響

溫度為 50℃，液料比為 10∶1（mL/g），時間為 60min時，pH值對黑豆蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 pH值對黑豆蛋白提取率的影響Fig.1 pH on the effect of protein extraction

黑豆蛋白提取率先隨pH值的增大而增加，這是由于堿性條件能使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得疏松，堿液對蛋白有增溶的效果。當pH值為9時，提取率達到最大值，之后提取率呈下降勢，可能是由于溶液堿性過大會導致蛋白質(zhì)中的氫鍵發(fā)生斷裂，使蛋白質(zhì)變性[10]。

2.2.2 液料比對黑豆蛋白提取率的影響

液料比對黑豆蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 液料比對黑豆蛋白提取率的影響Fig.2 Liquid－solid ratio on the effect of protein extraction

由圖2可知，當溫度為50℃，pH值為8，時間為60 min時，整體呈先上升后下降的趨勢，當液料比為12∶1（mL/g）時，提取率達到最大值。液料比較低的條件下，蛋白的提取率也較低，其原因是溶液較少，體系分散不均，使得蛋白質(zhì)無法充分溶解[11]。

2.2.3 溫度對黑豆蛋白提取率的影響

當 pH 值為 8，時間為 60 min，液料比 10 ∶1（mL/g）時，溫度對黑豆蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 溫度對黑豆蛋白提取率的影響Fig.3 Temperature on the effect of protein extraction

由圖3可知，隨著溫度的升高，提取率呈先上升后下降的趨勢，當溫度為50℃時，提取率達到最大值為46.8%，之后提取率下降，原因在于溫度過高會導致蛋白質(zhì)的變性[12]，從而影響蛋白質(zhì)的提取。

2.2.4 時間對黑豆蛋白提取率的影響

時間對黑豆蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 時間對黑豆蛋白提取率的影響Fig.4 Time on the effect of protein extraction

由圖4可知，在溫度為50℃，pH值為8，液料比10∶1（mL/g）的條件下，隨著黑豆浸提時間延長，蛋白的溶出率越高，當浸提時間為50 min時，提取效果最好。當浸提時間超過50 min時，蛋白質(zhì)提取率開始下降，說明浸提時間過長會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而使蛋白提取率下降。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應(yīng)試驗安排及結(jié)果

試驗應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進行過程優(yōu)化。以X1pH值、X2液料比（mL/g）、X3提取溫度（℃）、X4提取時間（min）為自變量，以分離蛋白提取率為響應(yīng)值Y，響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表3。

2.3.2 對黑豆蛋白提取率的響應(yīng)面結(jié)果分析

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：Y=50.29+0.38X1+0.038 0X2+0.55X3+0.81X4-0.25X1X2+0.048X1X3+0.036X1X4+0.39X2X3+0.50X2X4-0.077X3X4-1.85X12-1.57X22-2.14X32-1.62X42。回歸分析與方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗方案及試驗結(jié)果Table 3 Design and result of response surface analysis

表4 回歸與方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression and variance analysis

續(xù)表4 回歸與方差分析結(jié)果Continue table 4 Results of regression and variance analysis

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，并且該模型R2=97.28%，R2Adj=94.74%，說明該模型與試驗擬合良好。自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析，當pH值為9，液料比為12∶1（mL/g），溫度 51℃，時間 53 min時，響應(yīng)面最優(yōu)值為（50.45±0.32）%。響應(yīng)面圖見5～圖8。

圖5 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

從圖5、圖6、圖7、圖8可以看出提取溫度、提取時間對提取效率影響顯著。在因素水平范圍，開始時提取率隨液料比的增大逐漸增大，達到最大理論之后緩慢減小。

2.3.3 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面得到的最優(yōu)值，即pH值為9，液料比為 12∶1（mL/g），溫度 52℃，時間 53 min的條件下，試驗進行了3次平行試驗，結(jié)果3次試驗平均值即黑豆蛋白平均提取率為50.21%，與響應(yīng)面分析得到的黑豆蛋白提取的理想值（50.45±0.32）%很接近，說明試驗效果較好。

圖6 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的等高線圖Fig.6 Contour plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

圖7 液料比和時間對黑豆蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of combined effects of liquid-soild ratio and time on black bean protein extraction

圖8 液料比和溫度對黑豆蛋白提取率影響的等高線圖Fig.8 Contour plot of combined effects of liquid-soild ratio and temperature on black bean protein extraction

2.4 黑豆蛋白功能性質(zhì)的測定

2.4.1 溶解性

黑豆蛋白溶解性的測定結(jié)果見圖9。

圖9 黑豆蛋白溶解性的測定Fig.9 Determination of black bean protein solubility

在強酸環(huán)境下，蛋白分子多數(shù)是作為正極粒子，產(chǎn)生相斥作用，分散性良好，會使溶解性增加；在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得比較疏松，表面蛋白質(zhì)分子帶一樣電荷，促進蛋白質(zhì)與結(jié)合物分離，使黑豆蛋白質(zhì)的溶解性提高[13]。因黑豆蛋白等電點pH值在4.5左右，在這個pH值環(huán)境下，阻礙了蛋白質(zhì)多肽鏈之間靜電彼此排斥作用，進而打亂了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使其溶解性降低。

2.4.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性

黑豆蛋白乳化性，乳化穩(wěn)定性的測定結(jié)果見圖10。

圖10 黑豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定Fig.10 Determination of emulsifying and emulsifying stability of black bean protein

黑豆蛋白乳化性隨著pH值的增大而增大。乳化性的持續(xù)增漲可能是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團隨著pH值的增大而暴露的更充分，增加了油水界面的吸附量，使界面張力減小，從而提高了乳化性[14]。乳化穩(wěn)定性則是隨著pH值的升高而升高，當pH值為7時達到最高點，隨后減小。原因是在pH值小于7時，還沒有形成飽滿的界面使油滴穩(wěn)定，故在這個過程中吸附了大量微小的蛋白質(zhì)顆粒，增加了乳化穩(wěn)定性[15]。

2.4.3 起泡性和起泡穩(wěn)定性

黑豆蛋白起泡性、起泡穩(wěn)定性的測定結(jié)果見圖11。

蛋白質(zhì)當pH值是5時，起泡性處于最大，但隨pH值的變大，起泡性反而呈下降趨勢。起泡穩(wěn)定性是當pH值處于7時曲線到達最頂點，于酸性范疇pH值的變大，起泡穩(wěn)定性也相對的升高。但堿性范疇下跟隨pH值的變大，起泡穩(wěn)定性稍微下降。有相關(guān)研究表示，沒有溶解的蛋白質(zhì)粒子可以提升起泡穩(wěn)定性[16]。其次較大分子量的蛋白具有穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)，也可提升起泡穩(wěn)定性[17]。

圖11 黑豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定Fig.11 Determination of foamability and foam stability of black bean protein

2.4.4 持水性

蛋白質(zhì)的持水性是指在食品加工過程中蛋白質(zhì)中的水分以及添加到蛋白質(zhì)中水分的保持能力，與食品的質(zhì)構(gòu)有密切關(guān)系[18]。按照上述2.3.4.4的步驟進行試驗，并測得黑豆蛋白質(zhì)的持水性為WHC（mL/g）=2.10。

2.4.5 持油性

蛋白質(zhì)的持油性表示蛋白制品吸附油的性能[19]。按照上述2.3.4.5的步驟開展試驗，并測得黑豆蛋白質(zhì)的持油性為 OHC（mL/g）=3.15。

3 結(jié)論

試驗利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了黑豆蛋白的提取工藝，得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)：液料比為 12∶1（mL/g）、pH值為9、提取溫度為51℃、浸提時間為53 min。此時黑豆蛋白提取率可達50.45%。試驗對提取的黑豆蛋白功能特性進行了測定，結(jié)果表明黑豆蛋白的溶解性最高為57.33%；乳化性最大為17.22 m2/g；乳化穩(wěn)定性最佳為120.17 min；起泡性最好為39.66%；起泡穩(wěn)定性最優(yōu)為65.33%；持水性為2.10 mL/g；持油性為3.15 mL/g。說明采用堿溶酸沉法提取的黑豆蛋白具有良好的功能特性，可用于日后進一步的食品加工。此試驗為黑豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定的借鑒意義。